徐心悅，趙桐樺，萬麗瓊，羅麟霜，索玉凱*，何飛飛

1. 云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點實驗室（昆明 650000）；2. 云南大學(xué)資源植物研究院·農(nóng)學(xué)院（昆明 650000）

咖啡豆是茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）植物的種子，其經(jīng)過烘焙后具有特殊的香氣[1]。云南是我國最大的咖啡生產(chǎn)區(qū)，主要種植品種為小?？Х龋–offea arabicaLinn.）[2]?？Х瘸跫庸な侵赣煽Х弱r果制成咖啡生豆的過程，其意義在于借助微生物和咖啡中酶的作用，將咖啡內(nèi)的糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醇類、酸類和酮類等芳香物質(zhì)，從而使咖啡豆呈現(xiàn)不同風(fēng)味，是形成商品豆的重要環(huán)節(jié)[3-4]。

近年來，微生物發(fā)酵對咖啡風(fēng)味的影響及咖啡專用發(fā)酵劑的開發(fā)成為咖啡產(chǎn)業(yè)的研究熱點。Wang等[5]研究表明添加葡萄糖調(diào)控乳酸乳球菌亞種（Lactococcuslactissubsp.cremoris）發(fā)酵咖啡生豆，可以顯著提高咖啡的風(fēng)味品質(zhì)。云南咖啡與精品咖啡豆相比，存在花果香風(fēng)味不足的問題[6]。因此，開發(fā)增強(qiáng)咖啡花果風(fēng)味的微生物發(fā)酵劑，對于提升云南咖啡的風(fēng)味品質(zhì)十分必要。

酵母菌作為兼性厭氧微生物，在咖啡的自然發(fā)酵過程中起著重要作用[7]。我國研究者利用外源釀酒酵母發(fā)酵改善咖啡風(fēng)味，并取得一定進(jìn)展[6,8]，但對于云南小?？Х茸匀话l(fā)酵過程中的產(chǎn)香酵母尚缺乏系統(tǒng)挖掘。試驗從云南主要咖啡產(chǎn)區(qū)（保山、普洱、德宏和臨滄）的咖啡鮮果和發(fā)酵過程中篩選產(chǎn)香酵母，并利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析其主要代謝產(chǎn)物，從而為小?？Х葘Ｓ冒l(fā)酵劑的開發(fā)奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料

小粒咖啡鮮果采自保山、普洱、德宏和臨滄的咖啡莊園；采摘的同一批次咖啡豆分別進(jìn)行濕法處理和半干法處理，并在處理末期取樣。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，固體培養(yǎng)基添加瓊脂20 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，果糖16.1 g/L，半乳糖0.1 g/L，甘露糖0.3 g/L，葡萄糖8.5 g/L。

1.1.3 試驗試劑

蛋白胨、酵母粉（OXOID）；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖（上海源葉生物科技有限公司）；二氯甲烷、乙酸乙酯（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.1.4 試驗儀器

752N紫外可見分光光度計（上海昂拉儀器有限公司）；THZ-98AB恒溫振蕩器（上海一恒科技有限公司）；TP600PCR儀（TaKaRa）；D-37520小型臺式離心機(jī)（德國Sigma公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；YXQ-50S11立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司）；AgilengtGCMS7890B 5977A MSD氣相色譜/質(zhì)譜分析聯(lián)用儀（Agilent Technologies）。

1.2 試驗方法

1.2.1 咖啡內(nèi)生酵母的分離純化

咖啡鮮果經(jīng)蒸餾水沖洗后，經(jīng)75%乙醇漂洗5 min，經(jīng)無菌水洗滌3次，并在0.1%的次氯酸鈉中浸泡10 min，再用無菌水沖洗3次。處理好的咖啡果切開后，將果皮、果肉和咖啡豆分別置于YPD培養(yǎng)基平板，在28 ℃條件下培養(yǎng)2～4 d，待樣品邊緣處長出菌落。挑取菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，從而獲得酵母菌株，并將其保存至-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 咖啡濕法發(fā)酵和半干法發(fā)酵中酵母的分離

在咖啡豆?jié)穹òl(fā)酵和半干法發(fā)酵末期分別取樣，并將樣品保存于4 ℃?zhèn)溆?。在無菌條件下，對咖啡濕法發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋（10-1～10-7）。對于半干法處理的樣品，取2 g咖啡豆加入10 mL無菌水中，振蕩混勻5 min，將上清液進(jìn)行梯度稀釋（10-1～10-5）。隨后，將稀釋液分別涂布于YPD培養(yǎng)基平板，在28 ℃條件下培養(yǎng)2～4 d，待平板上長出菌落，將其進(jìn)行劃線培養(yǎng)分離。

1.2.3 產(chǎn)香酵母的鑒定與篩選

提取分離菌株的基因組DNA，并使用引物（上游：5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’；下游：5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’）擴(kuò)增5.8S rRNA部分序列。基于測序結(jié)果，采用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從而進(jìn)行分子鑒定。將酵母菌株在YPD液體培養(yǎng)基中活化后，以1%（V/V）接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，在28 ℃，150 r/min培養(yǎng)36 h，篩選能夠產(chǎn)香氣的菌株。

1.2.4 揮發(fā)性成分的提取

產(chǎn)香酵母以1%（V/V）接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，在28 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)36 h，離心取上清液，加入等體積的乙酸乙酯溶液，充分混勻后對其超聲處理（1 h）。靜置待其分層，吸取上層溶液，加入無水硫酸鈉，靜置4 h過濾得澄清溶液，脫水干燥后加入二氯甲烷復(fù)溶，用于GC-MS分析。

1.2.5 GC-MS分析

氣相色譜條件：色譜柱為Agilent VF-WAXms（30m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣，流量為1.5 mL/min；起始溫度50 ℃保持1 min，以6 ℃/min速率上升到150 ℃，保持2 min，以5 ℃/min速率上升到250℃，保持7 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比10∶1；進(jìn)樣體積1 μL。

質(zhì)譜條件：EI方式，氣質(zhì)接口溫度280 ℃，離子源溫度30 ℃，離子化電壓70 eV，掃描范圍35～500 amu，掃描速率1.65 scan/s，溶劑延遲4 min。

圖譜檢索：通過譜庫（NIST05，Wiley275）對所得揮發(fā)性成分進(jìn)行定性，用色譜峰面積歸一化法對各揮發(fā)性成分進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香酵母的分離鑒定

在菌株分離純化過程中，主要挑選呈現(xiàn)酵母菌落特性（質(zhì)地均勻、表面濕潤、黏稠、易挑起、較細(xì)菌菌落大而厚、乳白色），且培養(yǎng)時散發(fā)酵母香氣的菌落。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，從咖啡鮮果、咖啡濕法處理和半干法處理中共篩選到76株酵母，主要為畢赤克魯維酵母（Pichiakluyveri）、異常畢赤酵母（P.anomala）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）、矮小假絲酵母（Kazachstaniahumilis）和德爾布有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii）。其中，3株酵母的發(fā)酵液呈現(xiàn)出濃郁的花果香味，命名為Y03，Y09和Y24。將3株菌的5.8S rRNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源比對，并利用NeighborJoin法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果表明，Y03，Y09和Y24分別與K.humilisCh1、K.humilisYMX000387和H.uvarumPMM09-2765L聚于同一個分支，同源性都在99%以上（圖1），初步判定Y03和Y09為K.humilis，Y24為H.uvarum。

圖1 酵母菌株基于5.8S rRNA序列進(jìn)化樹

2.2 酵母發(fā)酵液揮發(fā)性成分總離子圖譜分析

咖啡果肉中的糖類成分主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖組成，為評估3株酵母以咖啡果肉為底物進(jìn)行發(fā)酵時所產(chǎn)的揮發(fā)性物質(zhì)，模擬咖啡果肉的糖組成進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵。3株酵母發(fā)酵液揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖見圖2，得到的譜圖與NIST05，Wiley275譜庫檢索及對比分析，用色譜峰面積歸一化法對各揮發(fā)性成分進(jìn)行定量，鑒定出的揮發(fā)性成分和相對含量見表1。

表1 3種不同酵母發(fā)酵的發(fā)酵液揮發(fā)性成分

圖2 菌株發(fā)酵液揮發(fā)性成分總離子流圖

2.3 不同酵母發(fā)酵的發(fā)酵液揮發(fā)性成分定性定量分析

利用數(shù)據(jù)庫檢索及數(shù)據(jù)分析，對3株酵母發(fā)酵液的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性定量。由圖2和表1可知：Y03菌株發(fā)酵液經(jīng)過GC-MS分析，能檢測到的揮發(fā)性成分主要有40種，包括醇類（40.25%）、肽類（22.12%）、酮類（11.97%）、含硫化合物（9.60%）、酯類（8.76%）、其他化合物（2.84%）、糖類（2.07%）、胺類（1.09%）、酚類（0.83%）、雜環(huán)類（0.29%）、烷烴類（0.1%）、酸類（0.08%）；相對含量較高的物質(zhì)為苯乙醇、2, 3-二氫-3, 5二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、對羥基苯乙醇、苯乙酸，4-十四酯、乙酸苯乙酯、呋喃酮、異戊酸香葉酯，分別占35.65%，4.38%，4.26%，2.01%，1.17%，0.69%和0.61%。Y09菌株發(fā)酵液能檢測到的揮發(fā)性成分主要有35種，包括醇類（38.89%）、肽類（18.47%）、酮類（11.13%）、胺類（10.48%）、酯類（8.67%）、其他化合物（4.00%）、醚類（2.49%）、糖類（1.58%）、吡喃（1.23%）、烷烴類（1.05%）、苯（0.98%）、酚類（0.86%）、醛類（0.17%）；相對含量較高的物質(zhì)為苯乙醇、六氫吡咯并[1, 2-A]吡嗪-1, 4-二酮、對羥基苯乙醇、苯乙酸，4-十四酯、2, 3-二氫-3, 5二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、鄰苯二甲酸二丁酯、乙酸苯乙酯，分別占30.56%，7.07%，4.72%，2.51%，2.10%，1.36%和1.29%。Y24菌株發(fā)酵液能檢測到的揮發(fā)性成分主要有31種，包括醇類（29.63%）、肽類（28.63%）、酮類（18.17%）、胺類（10.67%）、酯類（3.33%）、其他化合物（2.49%）、醚類（2.27%）、糖類（2.09%）、吡喃（1.12%）、烷烴類（0.70%）、苯（0.60%）、酚類（0.29%）；相對含量較高的物質(zhì)為苯乙醇、六氫-3-（苯基甲基）吡咯并[1, 2-A]吡嗪-1, 4-二酮、六氫吡咯并[1, 2-A]吡嗪-1, 4-二酮、2, 3-二氫-3, 5二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、對羥基苯乙醇、鄰苯二甲酸二丁酯，分別占14.05%，13.30%，9.96%，3.43%，2.26%和1.86%。因此，3株酵母經(jīng)發(fā)酵后可以產(chǎn)生大量的醇類、酯類和酮類等揮發(fā)性物質(zhì)。

3 討論

為篩選云南小?？Х仍a(chǎn)香酵母，試驗對咖啡鮮果、咖啡濕法處理和半干法處理中的酵母進(jìn)行分離純化，發(fā)酵試驗表明菌株Y03，Y09和Y24可以產(chǎn)生濃郁的花果香氣。GC-MS分析結(jié)果表明，3株酵母在發(fā)酵中可以產(chǎn)生醇類、酯類、酮類和酸類等芳香類物質(zhì)。酯類化合物大多都具有水果和花香味道，它們的來源主要由脂肪酸和醇類化合物的酯化反應(yīng)，并且微生物在細(xì)胞內(nèi)可以通過代謝合成酯類化合物，一般是使用高級醇，在乙酰轉(zhuǎn)移酶作用下合成[9]。酮類化合物大部分都具令人愉快的氣味，在揮發(fā)性物質(zhì)組成上占有重要地位。醇類化合物和水都是極性分子，這些分子都具有羥基這個極性基團(tuán)，因為氫鍵的作用力會將醇和水分子的排列方式一步一步理順，進(jìn)而加強(qiáng)醇類化合物的水分子束縛力，降低了醇分子的活度，在味道的感覺上顯現(xiàn)為圓潤柔和，可與香味成分共同協(xié)調(diào)[10]。進(jìn)一步分析3株酵母的揮發(fā)性成分發(fā)現(xiàn)，苯乙醇是玫瑰香氣的無色液體，在我國可當(dāng)作食用香料使用[11]；異戊酸香葉酯為無色至微黃色液體，帶有濃郁蘋果、菠蘿的果味香氣，并且有玫瑰香；乙酸苯乙酯是無色的油性透明液體，具有玫瑰香氣和蜂蜜香氣，在食品工業(yè)中可以用作食用香料[12]；異戊酸是無色黏稠狀液體，稀釋后具有甜的果香，并且還有篤斯越橘的香味，是我國規(guī)定可以使用的食用香料[13]；2, 3-二氫-3, 5二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮屬于吡喃烯醇酮類化合物，這類具有環(huán)狀烯醇酮類的化合物大多具有焦糖樣香味，在味覺上呈現(xiàn)出的“甜味”更加突出[14]。上述化合物不僅有特殊的香氣，其在發(fā)酵液中含量也相對較高。因此，篩選出的咖啡原生酵母菌可以產(chǎn)生花果香味物質(zhì)，在強(qiáng)化云南小粒品質(zhì)方面有著較大的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

從咖啡鮮果、咖啡濕法處理和半干法處理中共篩選到76株酵母，其中3株酵母在發(fā)酵中產(chǎn)香濃郁。隨后的分子鑒定表明，Y03和Y09菌株為K.humilis，Y24菌株為H.uvarum。GC-MS分析結(jié)果表明，3株酵母在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生苯乙醇、乙酸苯乙酯、異戊酸等具有花果香氣的醇類、酯類、酸類和酮類物質(zhì)，下一步可用于云南咖啡發(fā)酵，從而彌補(bǔ)小粒咖啡花果香不足的缺陷。