甘璐，孫曉春，彭國平，張潔，熊紹風，饒毅

1.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004；2.南昌大學第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；3.江西應用科技學院，江西南昌 330100

糖尿病是當今世界三大疾病之一，其發(fā)病率及死亡率逐年上升，已成為各國關(guān)注的公眾健康難題［1］。眾所周知，糖尿病是一種體內(nèi)呈現(xiàn)以高血糖為特征的蛋白質(zhì)、糖、脂肪代謝等紊亂的綜合性疾病，也是一種常見的慢性?。?］。正常的血管內(nèi)皮細胞能夠產(chǎn)生許多有益的細胞因子，達到維持血管的正常舒縮、抗血栓、抑制脂質(zhì)聚積，抗炎等功能。當血管內(nèi)過多的葡萄糖和脂質(zhì)長期刺激內(nèi)皮細胞時，會造成內(nèi)皮細胞功能失常，這種失常也為糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生提供了始動因素［3］。

黃酮類化合物是有諸多藥理作用的一類物質(zhì)，通常具有抗腫瘤，抗炎，抗氧化，抗病毒等多種藥理活性［4-7］。刺槐素（acacetin,ACA,5,7-二羥基-4'-甲氧基黃酮）是天然的黃酮類化合物，廣泛存在于多種傳統(tǒng)藥用植物中，具有多種藥理活性［8-12］。深入研究血管內(nèi)皮細胞功能失調(diào)產(chǎn)生的相關(guān)病理機制或相關(guān)作用分子及藥物是治療代謝綜合征的重要方向，也是提高患者的生活質(zhì)量的重要方法，同時，糖尿病患者心腦血管并發(fā)癥的發(fā)病率也會大大降低［13］。本研究從ACA 對高糖/高脂（HG/HF）應激下人體臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）功能失常的保護作用及其相關(guān)機制出發(fā)，探究ACA 對HG/HF 應激HUVECs功能失常的保護作用。確認ACA 對HG/HF 應激誘導內(nèi)皮功能失常的保護作用是否與PPARγ/NF-κB通路有關(guān)，為臨床上治療HG/HF 應激下的血管內(nèi)皮細胞失常及周圍血管病提供重要的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株、培養(yǎng)基及血清

實驗用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）株購自美國ATCC（Catalog No: CRL1730）；胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司。

1.2 試劑盒及試劑

人內(nèi)皮素-1（ET-1）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（EK-M28801）、NO 檢測試劑盒（R-1045）與凋亡試劑盒（G003-1-3）均購自南京建成科技有限公司；qRT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（#22106-01）購自Tolobio公司；其他未詳列試劑均購自北京Solarbio 公司。

1.3 主要儀器

680 型酶標儀（BIO-RAD，美國）；逆轉(zhuǎn)錄儀（BIO-RAD，美國）；PCR 儀（BIO-RAD，美國）；流式細胞儀（Beckman Coulter，美國）。

2 方法

2.1 HUVECs 細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)參照熊紹風［14］的細胞方法進行，用1%內(nèi)皮細胞生長因子（ECGS）和10%FBS 含雙抗（青霉素-鏈霉素）的DMEM 作為細胞培養(yǎng)基，細胞放置于37 ℃，含5% CO2的恒溫孵育箱中培養(yǎng)。

2.2 劃痕實驗檢測細胞愈合修復水平

HUVECs 以每孔2×105個接種于6 孔板中孵育，待細胞長至融合度為90%時，用200 μL 槍頭沿著直線劃細胞，然后棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗三遍；后加入完全培養(yǎng)基；繼續(xù)放入孵箱24 h，其中在0 h，24 h 時間點取出置于倒置顯微鏡下觀察細胞愈合距離的變化并做好記錄。

2.3 流式細胞儀測定HUVECs 細胞凋亡水平

根據(jù)試劑盒說明書要求，按步驟依次加入各種試劑，最后采用流式細胞儀測定。

2.4 硝酸還原酶法測定NO 含量

取細胞上清液至EP 管中，分為空白管、標準管和測定管。按照NO 試劑盒說明書配好試劑并加入到EP 管中混勻，37 ℃水浴60 min，最后取上清液進行后續(xù)操作；加入顯色劑后混勻，室溫靜置10 min，用酶標儀在550 nm 下測定吸光度值。

2.5 qRT-PCR 檢測PPARγ/NF-κB 通路mRNA

用胰島素（100 nmol/L）處理30 min，去除細胞上清液，采用Trizol 法提取各組細胞RNA，用qRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR 擴增體系為20 μL，其中cDNA 為2 μL，上下游引物各0.8 μL，PCR 循環(huán)數(shù)為39，95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸32 s［15］，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2.6 ELISA 法檢測細胞上清液ET-1 水平

按說明書步驟用標準溶液建立標準曲線，樣品準備，封閉，上一抗二抗，加顯色劑顯色，最后用酶標儀測定吸光度，代入標準曲線中計算樣品的ET-1 含量。

2.7 實驗分組

2.7.1不同濃度ACA 對HUVECs 細胞活力的影響將HUVECs 細胞均勻接種于培養(yǎng)皿，隨機分為七組，即Ctrl 組（加入正常培養(yǎng)基），ACA（濃度為5、10、20、40、80、160 μmol/L）組。

2.7.2ACA 對HG/HF應激下HUVECs細胞損傷的影響將HUVECs 細胞均勻接種于培養(yǎng)皿，隨機分為四組，即Ctrl、HG/HF（44/1.0 mmol/L）、ACA（40 μmol/L）、HG/HF+ACA（40 μmol/L）組。

2.7.3PPARγ/NF-κB 通路抑制劑逆轉(zhuǎn)ACA 對HG/HF應激下HUVECs 細胞損傷的修復作用將HUVECs細胞均勻接種于培養(yǎng)皿，隨機分為五組，即Ctrl、HG/HF（44/1.0 mmol/L）、ACA（40 μmol/L）、HG/HF+ACA（40 μmol/L）、HG/HF+ACA（40 μmol/L）+T0070907（10 μmol/L）組。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 不同濃度ACA 對 HUVECs 細胞活力的影響

圖1 結(jié)果顯示：當ACA 濃度大于或等于80 μmol/L時，細胞活力顯著下降（P<0.01），呈現(xiàn)出明顯的細胞毒性，因此確認藥物安全濃度范圍為小于或等于40 μmol/L，同時選擇40 μmol/L 作為實驗最適濃度。

圖1 不同濃度ACA對 HUVECs 細胞活力的影響

3.2 ACA 對HG/HF 應激下HUVECs 細胞損傷的影響

根據(jù)分組要求處理細胞24 h 后，檢測ACA 對HUVECs 細胞損傷的影響，同時檢測ACA 對HUVECs細胞PPARγ/NF-κB 通路的影響。

3.2.1ACA 對HG/HF 應激下HUVECs 細胞愈合率的影響如圖2 所示，HG/HF 組的細胞愈合率相比于Ctrl 組顯著下降（P<0.01），然而加入HG/HF+ACA的實驗組細胞愈合率比HG/HF 組明顯提高，與正常組的愈合率接近。

圖2 ACA對HG/HF應激下HUVECs細胞愈合率的影響：A.細胞劃痕圖；B.細胞遷移率

3.2.2ACA 對HG/HF 應激下HUVECs 細胞凋亡率的影響如圖3 所示，HG/HF 組的細胞凋亡率相比于Ctrl 組顯著升高（P<0.01），然而加入HG/HF+ACA的實驗組細胞凋亡率比HG/HF 組明顯降低，與正常組的凋亡率接近。

圖3 ACA對HG/HF應激下HUVECs細胞凋亡率的影響：A.細胞凋亡圖；B.細胞凋亡率

3.2.3ACA 對HG/HF 應激下HUVECs 細胞ET-1、NO含量的影響如圖4 所示，ACA 可以逆轉(zhuǎn)由HG/HF應激介導的ET-1 含量的增加和NO 含量的減少。

圖4 ACA對HG/HF應激下HUVECs細胞ET-1、NO的影響：A.ET-1含量；B.NO含量

3.2.4ACA 對HG/HF 應激下HUVECs 細胞PPARγ/NF-κB 通路mRNA 的影響如圖5 所示，HG/HF應激能顯著降低PPARγ 和NF-κB 的mRNA 表達，而在ACA 的加入下，PPARγ 和NF-κB 的mRNA表達顯著增加。

圖5 ACA對HG/HF應激下HUVECs細胞PPARγ/NF-κB通路mRNA的影響

3.3 T0070907 逆轉(zhuǎn)ACA 對HG/HF 應激下HUVECs細胞損傷的修復作用

根據(jù)分組要求，處理細胞24 h 后，檢測PPARγ/NF-κB通路抑制劑參與下ACA對HG/HF應急下HUVECs 細胞損傷的影響。

3.3.1對PPARγ/NF-κB 通路mRNA 的影響如圖6所示，PPARγ/NF-κB 通路抑制劑的加入能夠明顯抑制PPARγ 和NF-κB 的mRNA 的表達。

3.3.2對HG/HF 應激下HUVECs 細胞愈合修復作用如圖7 所示，PPARγ/NF-κB 通路抑制劑的加入能夠明顯抑制ACA 對HG/HF 應激下HUVECs 細胞愈合的修復作用。

圖7 對HG/HF應激下HUVECs細胞愈合修復作用：A.細胞劃痕圖；B.細胞遷移率

3.3.3對HG/HF 應激下HUVECs 細胞凋亡的修復作用如圖8 所示，PPARγ/NF-κB 通路抑制劑的加入能夠明顯抑制ACA 對HG/HF 應激下HUVECs 細胞凋亡的修復作用。

圖8 對HG/HF應激下HUVECs細胞凋亡的修復作用：A.細胞凋亡圖；B.細胞凋亡率

3.3.4對HG/HF 應激下HUVECs 細胞ET-1、NO 含量的影響如圖9 所示，PPARγ/NF-κB 通路抑制劑的加入能夠明顯抑制ACA 對HG/HF 應激下HUVECs細胞ET-1 含量的減少和NO 含量的增加。

圖9 對HG/HF應激下HUVECs細胞ET-1、NO的影響：A.ET-1含量；B.NO含量

4 討論

高脂血癥、糖尿病等代謝性疾病與血管功能障礙密切相關(guān)，并加速著血管功能障礙的進展，同時血管功能障礙也增加心腦血管疾病患病幾率［16］。血糖慢性增高則是糖尿病最顯著的特征，且隨著病情的進展，會導致一系列并發(fā)癥（如視網(wǎng)膜病變、周圍神經(jīng)病變、糖尿病腎病、糖尿病足及周圍血管病變等）的發(fā)生，給患者的日常生活及身心健康帶來了嚴重的影響［17-19］。高血脂是導致糖耐量發(fā)生異常的一個危險促進因素。長期高血糖合并高血脂，將給機體的正常代謝帶來嚴重損害，使得患者并發(fā)癥的發(fā)生率顯著升高［20］。已有研究證實HG/HF 可以誘導HUVECs 細胞功能失常［21］，因此，明確HUVECs 細胞功能失常的作用機制對防治包括糖尿病血管并發(fā)癥和動脈粥樣硬化等疾病有重要意義。

有研究證實，ACA 可以通過抑制細胞內(nèi)氧化應激和ERS 來保護RINm5F 胰島β 細胞免受脂毒性介導的胰島損傷，且ACA 對胰島細胞的保護作用可能與CHOP 介導的凋亡途徑密切相關(guān)［22］。網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)預測了ACA 作用的潛在靶點為TNF-α，信號通路為IKKα/β-NF-κB，并闡明了ACA 可通過抑制HG 誘導的NF-κB 入核和轉(zhuǎn)錄活性的異常升高，降低TNF-α 水平以此改善HG 誘導IR［23］。

本研究從NO 含量、ET-1 含量、細胞愈合率和細胞凋亡率四個方面探究ACA 對HG/HF 應激造成的HUVECs 細胞功能失常的修復作用，并且發(fā)現(xiàn)其修復作用機制可能是通過激活PPARγ/NF-κB 通路實現(xiàn)的，為研究高糖高脂引起的內(nèi)皮細胞功能失常提供了新靶點，同時，為臨床上治療動脈粥樣硬化等血管內(nèi)皮失調(diào)性疾病提供了理論依據(jù)。但由于實驗條件的局限性，本研究僅在細胞水平證明了ACA的作用，接下來我們將從動物實驗方面進行進一步驗證。