方連明 姜亮 湯桂鈞 王赟 卜順?lè)?殷家棟 陸錦明

（1 上海市閔行區(qū)三農(nóng)綜合服務(wù)中心，上海 201109；2 上海市閔行區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，上海 201199；3上海銘桂實(shí)業(yè)有限公司，上海 201101） *為通信作者

十二卷屬花卉是近年來(lái)在我國(guó)快速發(fā)展流行的名貴觀賞花卉，已逐漸走進(jìn)尋常百姓家，成為了市民選購(gòu)盆栽中的新寵[1]，極適宜在辦公室、居室、廳堂、陽(yáng)臺(tái)等處作擺放裝飾用，具有清新、優(yōu)雅之美，同時(shí)可吸收空氣中的有害氣體，從而潔凈空氣，具有一定的環(huán)保功能。十二卷屬多肉類植物有4 個(gè)大類，分別為“萬(wàn)象”“玉扇”“壽錦”“玉露”，品種繁多，且都有抽生花梗的習(xí)性，即在花梗頂端著生幾十朵小花（小花是十二卷屬多肉類植物特有的繁殖器官，但大多是花而不實(shí)，需人工授粉）。

十二卷屬植物與很多木本植物及部分草本植物有抽生花梗的相似特性，且其花梗的每個(gè)節(jié)間中均隱藏有腋芽，故可通過(guò)刺激腋芽發(fā)育成幼芽，再通過(guò)側(cè)芽(腋芽)分生組織發(fā)育成枝條(植株)[2]?！街洹前俸峡剖韺佟叭f(wàn)象”系列中的名貴新品種，是國(guó)際上著名的“萬(wàn)象”四大品種之一，種苗價(jià)格十分昂貴。在此背景下，為獲得價(jià)廉物美的‘山之翠’優(yōu)質(zhì)種苗，筆者在數(shù)年前獨(dú)家引進(jìn)‘山之翠’專利品種的種苗進(jìn)行盆栽養(yǎng)護(hù)，并應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)其半木質(zhì)化的花梗，進(jìn)行了嫩莖段離體發(fā)生培養(yǎng)試驗(yàn)，以期刺激腋芽萌發(fā)并長(zhǎng)成“叢生芽”，從而為育成試管苗夯實(shí)基礎(chǔ)。筆者經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，‘山之翠’花梗離體發(fā)生培養(yǎng)終獲成功。現(xiàn)將相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下，以供相關(guān)人員參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及品種來(lái)源

試驗(yàn)在上海銘桂實(shí)業(yè)有限公司（上海市松江區(qū)場(chǎng)西路398 號(hào)）的組織培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行。新品種供試‘山之翠’是由上海銘桂實(shí)業(yè)有限公司自國(guó)外獨(dú)家引種的專利品種苗。

1.2 材料處理

1.2.1 材料來(lái)源與取材時(shí)間

培養(yǎng)材料為盆栽2年后的‘山之翠’大苗。于2021年9月中旬，盆栽的‘山之翠’肉質(zhì)葉片葉叢中抽出花梗，長(zhǎng)度為35 cm 左右；9 月21 日，花梗頂部最下端約有1/4 的花朵已開(kāi)花，整支花梗有彈性，呈“半木質(zhì)化”狀態(tài)，自基部將整支花梗剪下，并立即將其置于盛有清水的玻璃瓶中，以防花梗失水萎蔫。

1.2.2 外植體材料的清洗與消毒

取材當(dāng)天，將花梗進(jìn)行處理。先剪去基部2 cm左右、已老熟以及頂端幼嫩尚未達(dá)半木質(zhì)化的部分，并剪去花蕾（朵），留長(zhǎng)度為30～40 cm 的花梗，用洗潔精清洗3 遍，然后將花梗剪成長(zhǎng)度為8 cm 左右的嫩莖段，用干凈紗布包裹后置于自來(lái)水龍頭下沖洗3 h，再將沖洗干凈的嫩莖段置于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒處理，即先用75%酒精消毒1 min、無(wú)菌水沖洗1 次，再用15%次氯酸鈉消毒15 min、無(wú)菌水沖洗3 次，最后用無(wú)菌濾紙吸干水分備用。

1.2.3 嫩莖段切割與接種

在超凈工作臺(tái)上將已消毒的嫩莖段切成長(zhǎng)為2 cm的莖段，每段帶1～2個(gè)莖節(jié)，接種于發(fā)生培養(yǎng)基上，每瓶接種1個(gè)莖段。為比較觀察嫩莖段發(fā)生培養(yǎng)與其他培養(yǎng)方法的優(yōu)劣，以相同品種的肉質(zhì)葉片和當(dāng)年授粉獲得的種子為對(duì)照，分別接種30瓶進(jìn)行比較。其中，肉質(zhì)葉片切成大小為1 cm2的方塊，當(dāng)年授粉獲得的種子每瓶培養(yǎng)1粒，消毒方法同1.2.2。

1.3 花梗嫩莖段離體發(fā)生培養(yǎng)

為獲得合適的‘山之翠’離體發(fā)生培養(yǎng)基配方，共配制了6 種配方：(1）MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L ；(2）MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L；(3）MS+BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L；(4）MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.20 mg/L；(5）M S+BA 2.5 m g/L+N AA 0.25 mg/L ；(6）MS+BA 3.0 mg/L+NAA 0.30 mg/L。各種培養(yǎng)基配方均加蔗糖30 g/L、瓊脂粉5 g/L、活性炭2 g/L，調(diào)節(jié)pH 在5.8 左右。每種培養(yǎng)基配方配制30 瓶，每瓶灌裝50 mL 左右的培養(yǎng)基，每瓶接種1 個(gè)莖段，不設(shè)重復(fù)。

1.4 光照與溫度設(shè)置

設(shè)置培養(yǎng)室溫度為25 ℃、24 h 恒溫。為防止莖段離體消毒后產(chǎn)生褐化現(xiàn)象，接種后第1周內(nèi)保持暗培養(yǎng)、不加光，第2周開(kāi)始每天于7:00—20:00用LED 燈給予13 h 的光照，光照強(qiáng)度為3 500 lx 左右，培養(yǎng)架每層間距為40 cm。

1.5 調(diào)查統(tǒng)計(jì)

分別在培養(yǎng)約30 d、莖段腋芽開(kāi)始露白萌動(dòng)后，以及培養(yǎng)約60 d、腋芽明顯伸長(zhǎng)（有的長(zhǎng)出愈傷組織）后，觀察、調(diào)查、統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)基配方的莖段存活狀況，目測(cè)是否發(fā)生褐化或有無(wú)萌芽。同時(shí)，根據(jù)萌芽瓶數(shù)，計(jì)算“叢生芽”實(shí)際發(fā)生率(以腋芽伸長(zhǎng)3 mm 左右為準(zhǔn))，評(píng)價(jià)各材料、培養(yǎng)基配方的優(yōu)劣，篩選出最佳配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體材料的離體發(fā)生培養(yǎng)結(jié)果比較

由表1可知，采用花梗嫩莖段進(jìn)行離體發(fā)生培養(yǎng)具有顯著優(yōu)勢(shì)，“叢生芽”發(fā)生率達(dá)到了93.3%。在花梗嫩莖段離體發(fā)生培養(yǎng)中，于暗培養(yǎng)、不加光培養(yǎng)1周后觀察，大多數(shù)莖段仍保持綠色；在培養(yǎng)2周后，莖段節(jié)間腋芽開(kāi)始萌動(dòng)露白；在培養(yǎng)30 d 后，露白的節(jié)間上開(kāi)始長(zhǎng)出葉原基，并不斷生長(zhǎng)；在培養(yǎng)60 d 時(shí)，葉原基已長(zhǎng)成長(zhǎng)度在3 mm 以上的幼芽，并逐漸長(zhǎng)成“叢生芽”，預(yù)示花梗嫩莖段發(fā)生培養(yǎng)法取得基本成功，這一結(jié)果與前人的有關(guān)研究結(jié)果相似[3-4]。在肉質(zhì)葉片離體發(fā)生培養(yǎng)中，于培養(yǎng)30 d后，切口周邊逐漸膨大，以后緩慢長(zhǎng)出黃白色的愈傷組織，再經(jīng)幾周培養(yǎng)，愈傷組織不斷分化成長(zhǎng)為半透明的晶狀體（表面凹凸不平），再培養(yǎng)6個(gè)月后，愈傷組織表面開(kāi)始分化出芽點(diǎn)并不斷生長(zhǎng)，形成幼芽。在種子離體發(fā)生培養(yǎng)中，由于人工授粉結(jié)實(shí)種子的成熟度不一致，種子又十分細(xì)小，導(dǎo)致種子發(fā)芽不整齊，發(fā)芽率只有56.7%，且發(fā)芽后的種苗生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)勢(shì)不強(qiáng)，培養(yǎng)半年以上才形成“叢生芽”。以上結(jié)果表明，花梗嫩莖段是‘山之翠’外植體離體發(fā)生培養(yǎng)的最佳選擇，符合組織培養(yǎng)技術(shù)中“從芽到芽”的理論與實(shí)踐要求，故利用花梗嫩莖段進(jìn)行離體發(fā)生培養(yǎng)，對(duì)于加快繁育‘山之翠’這一名貴品種的優(yōu)質(zhì)種苗、保持品種優(yōu)良性狀等具有積極意義。

表1 不同外植體材料的離體發(fā)生培養(yǎng)結(jié)果比較

2.2 花梗嫩莖段不同發(fā)生培養(yǎng)基配方比較試驗(yàn)

由表2可知，在6種離體發(fā)生培養(yǎng)基配方中，以配方（4）的離體發(fā)生培養(yǎng)結(jié)果最好。具體表現(xiàn)為：據(jù)接種后1周觀察，配方（4）的嫩莖段仍保持綠色，無(wú)褐化現(xiàn)象，培養(yǎng)2周后發(fā)現(xiàn)，綠色莖段上端與下端切口已膨大并呈黃白色，表明愈傷組織已長(zhǎng)出，莖段已進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)階段；配方(3)與配方(4)的離體發(fā)生培養(yǎng)結(jié)果類似；配方(1)和配方(2)的離體發(fā)生培養(yǎng)結(jié)果一般；配方(5)和配方(6)的莖段上下端切口膨大現(xiàn)象較為突出，這可能與配方中的激素濃度較高有關(guān)。在培養(yǎng)近3 周時(shí)，配方（4）在莖段節(jié)間處的腋芽開(kāi)始萌動(dòng)露白，甚至有2 個(gè)節(jié)間的腋芽同時(shí)萌動(dòng)的現(xiàn)象，在培養(yǎng)30 d 后，露白的節(jié)間上開(kāi)始長(zhǎng)出葉原基并不斷生長(zhǎng)，在培養(yǎng)60 d 時(shí)，葉原基已長(zhǎng)成長(zhǎng)度在3 mm 以上的幼芽，葉片開(kāi)始展開(kāi)，幼葉顏色由黃白色轉(zhuǎn)為淺綠色，且隨著幼葉的不斷生長(zhǎng)，其圓柱肉質(zhì)形狀的葉片中長(zhǎng)出腋芽，起先有1～2 個(gè)，以后逐漸增多并由單個(gè)腋芽長(zhǎng)成小植株，有的在其基部長(zhǎng)出小芽（所有這些新芽組成“叢生芽”），這是‘山之翠’組織培養(yǎng)成功與否的起始步，也是關(guān)鍵一步；配方（1）、配方（2）的萌芽情況均不理想，莖段腋芽萌動(dòng)十分緩慢，有的莖段在培養(yǎng)3 周后仍未萌芽，呈“休眠”狀態(tài)，直至培養(yǎng)1個(gè)月后才稍有腋芽萌動(dòng)露白，但數(shù)量較少；配方（3）的萌芽稍快；配方（5）、配方（6）的萌芽萌動(dòng)露白與配方（4）差不多同時(shí)出現(xiàn)，但其萌動(dòng)的芽點(diǎn)僅不斷膨大，未長(zhǎng)成幼芽，且完全變成了亮白色、半透明的愈傷組織（似“蜂窩”狀，表面有小突起，突起呈淺綠色），約培養(yǎng)半年后，在降低激素濃度后又分化成幼芽，這可能與配方中激素濃度過(guò)高密切相關(guān)。有研究證實(shí)，在激素濃度較高時(shí)，有些莖段外植體需通過(guò)在愈傷組織階段產(chǎn)生不定芽，這種繁殖途徑的缺點(diǎn)是隨著愈傷組織繼代培養(yǎng)代數(shù)的增加，不定芽的形成能力逐漸下降，遺傳不穩(wěn)定性也隨之增加[5]。

表2 花梗嫩莖段不同培養(yǎng)基配方的離體發(fā)生培養(yǎng)結(jié)果比較

3 結(jié)論與討論

‘山之翠’是國(guó)際上十二卷屬“萬(wàn)象”系列中的四大名貴品種之一，其生長(zhǎng)緩慢，繁殖力低下，種苗奇缺，價(jià)格極其昂貴。以半木質(zhì)化的花梗嫩莖段作為外植體進(jìn)行離體發(fā)生培養(yǎng)，是快速獲得優(yōu)質(zhì)種苗、保持品種優(yōu)良特性及遺傳穩(wěn)定性的捷徑，具有事半功倍的效果。試驗(yàn)結(jié)果證明，采用‘山之翠’的花梗嫩莖段進(jìn)行離體發(fā)生培養(yǎng)具有顯著優(yōu)勢(shì)，在培養(yǎng)2周后，嫩莖段節(jié)間腋芽開(kāi)始萌動(dòng)露白；在培養(yǎng)30 d后，露白的節(jié)間上開(kāi)始長(zhǎng)出葉原基，并不斷生長(zhǎng)；培養(yǎng)60 d 時(shí)，葉原基已長(zhǎng)成長(zhǎng)度在3 mm 以上的幼芽，并逐漸長(zhǎng)成“叢生芽”， “叢生芽”發(fā)生率達(dá)到了93.3%，這為以后的繼代增殖培養(yǎng)乃至育出優(yōu)質(zhì)試管苗奠定了基礎(chǔ)。其中，培養(yǎng)基配方(4)（MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.20 mg/L）為最適宜進(jìn)行‘山之翠’花梗嫩莖段離體發(fā)生培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，在接種1～2周后，其嫩莖段仍保持綠色，無(wú)褐化現(xiàn)象發(fā)生，且綠色莖段上端與下端切口已膨大長(zhǎng)出愈傷組織，可以為莖段材料積累原始養(yǎng)分并供母體吸收；在培養(yǎng)60 d 時(shí)，葉原基已長(zhǎng)成長(zhǎng)度在3 mm 以上的幼芽，葉片開(kāi)始展開(kāi)，幼葉顏色由黃白色轉(zhuǎn)為淺綠色，且隨著幼葉不斷生長(zhǎng)，其圓柱肉質(zhì)形狀的葉片中長(zhǎng)出腋芽，并由單個(gè)腋芽長(zhǎng)成小植株，有的在其基部長(zhǎng)出小芽，由此組成“叢生芽”。

活性炭是一種無(wú)機(jī)礦物質(zhì)類吸附劑，對(duì)植物組織培養(yǎng)過(guò)程中的褐化現(xiàn)象有一定的抑制作用[6]。本試驗(yàn)在所有培養(yǎng)基配方中均添加了0.2%活性炭，這對(duì)抑制外植體材料的褐化起到了一定的作用。同時(shí)，筆者觀察到，不添加活性炭時(shí)，經(jīng)過(guò)消毒和切割后，‘山之翠’花梗嫩莖段出現(xiàn)了不同程度的褐化或腋芽萌動(dòng)延遲的現(xiàn)象，這是因?yàn)樵谙具^(guò)程中，‘山之翠’花梗嫩莖段被化學(xué)物質(zhì)殺傷、氧化，而花梗嫩莖段因切割而使多酚類物質(zhì)自切口外滲，從而發(fā)生了褐化、死亡。此外，筆者在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)消毒和切割后的‘山之翠’花梗嫩莖段在接種后，若馬上在加光狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)，亦會(huì)產(chǎn)生褐化或黃化現(xiàn)象，且即使在添加活性炭后仍有一定程度的褐化現(xiàn)象發(fā)生，其發(fā)生機(jī)理有待進(jìn)一步研究；而將接種后的培養(yǎng)瓶放至培養(yǎng)室后，在第1周內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)、不加光，在第2 周后每天給予13 h 的光照，起到了保障嫩莖段正常生長(zhǎng)的作用。因此，在發(fā)生培養(yǎng)基配方中添加0.2%活性炭及在接種后第1周內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)，是‘山之翠’半木質(zhì)化花梗莖段發(fā)生培養(yǎng)技術(shù)中的輔助方法，可防止或減輕嫩莖段出現(xiàn)褐化或黃化現(xiàn)象，確?；üＤ矍o段的發(fā)生培養(yǎng)成功。