陳仕鵬,謝瑞杰,劉代華*

(1.柳州市人民醫(yī)院 藥學(xué)部,廣西 柳州 545006;2.柳州市胃腸道中成藥工程技術(shù)研究中心,廣西 柳州 545006)

急性咽炎(Acute pharyngitis,AP)是臨床上常見(jiàn)的呼吸道傳染病之一,發(fā)生于人體咽部黏膜、黏膜下組織和淋巴組織的急性刺激,經(jīng)常通過(guò)病毒和細(xì)菌感染觸發(fā)。該疾病在人群中分布非常廣泛,主要發(fā)生于季節(jié)變化時(shí),除病毒病原體外,細(xì)菌病原體也可以導(dǎo)致咽喉感染[1]。廣義上急性咽炎常規(guī)治療包括抗生素及皮質(zhì)類固醇。抗生素易產(chǎn)生耐藥性,抗生素濫用會(huì)導(dǎo)致咽喉菌群失調(diào),繼而造成雙重污染,甚至病情進(jìn)一步惡化。同時(shí),激素療法也可以對(duì)內(nèi)分泌及體內(nèi)水鹽代謝產(chǎn)生影響。與單一抗生素、糖皮質(zhì)激素治療相比,中醫(yī)治療方法療效更加顯著,且不良反應(yīng)相對(duì)較少,安全性更高[2]。因此,研發(fā)治療急性咽炎的中藥制劑,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

潤(rùn)喉飲(Runhou decoction,RHD)為柳州市人民醫(yī)院的中藥復(fù)方制劑,由壯藥十大功勞、木蝴蝶、桔梗、生地和淡竹葉五味中藥組成,以中、壯醫(yī)辨證理論為指導(dǎo),具有清熱解毒、止渴生津、利咽潤(rùn)肺、疏肝和胃的功效,在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中,用于急性咽炎的治療,效果顯著,但其作用機(jī)制尚未明確。中藥復(fù)方憑借“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的作用機(jī)制,具有特殊的治病功效。然而從分子水平和系統(tǒng)角度理解中藥方劑的科學(xué)基礎(chǔ)仍然是循證中醫(yī)面臨的巨大挑戰(zhàn)之一[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是隨著生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)藥理學(xué)改進(jìn)而興起的一種分析方法,基于疾病、基因、目標(biāo)和藥物相互作用網(wǎng)絡(luò),通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析系統(tǒng)地觀察藥物對(duì)于疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響,解析藥物的作用機(jī)制并建立一種新策略闡述中藥方劑的組合規(guī)則,發(fā)現(xiàn)中藥藥物開發(fā)的有效成分和協(xié)同成分[4-5]。因此,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究RHD治療急性咽炎的作用機(jī)制,完善和補(bǔ)充RHD藥效學(xué)研究,促進(jìn)RHD復(fù)方優(yōu)化及進(jìn)一步開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 RHD制作工藝

淡竹葉150g,生地100g,木蝴蝶100g,十大功勞50g,桔梗50g,以上五味加2L水煎煮2次,每次1.5h,合并煎液過(guò)濾,濾液濃縮至相對(duì)密度為1.05～1.10,加乙醇使含醇量達(dá)到65%。放置12h以上使沉淀。取上清液回收乙醇濃縮至相對(duì)密度為1.25的浸膏。取浸膏1份加10份蔗糖粉及適量乙醇制成顆粒,干燥,即得。

1.2 RHD活性成分收集及篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php)、SYMMAP數(shù)據(jù)庫(kù)2.0(http://www.symmap.org/)、中國(guó)醫(yī)藥百科全書2.0(ETCM 2.0,http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/)對(duì)RHD中5種藥材活性成分進(jìn)行檢索并篩選。以類藥性(Drug-likeness,DL)≥0.18為參數(shù)對(duì)活性成分篩選[6],對(duì)于未提供化合物DL值的,采用ADMETlab網(wǎng)站(http://admet.scbdd.com/)預(yù)測(cè)化合物的DL值[7]。滿足條件的化合物為RHD潛在的活性成分。

1.3 RHD活性成分的靶點(diǎn)篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)TCMSP和ETCM 2.0檢索活性成分時(shí),可直接篩選其已知的作用靶點(diǎn)。對(duì)于SYMMAP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到的活性成分,通過(guò)經(jīng)SIB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstarget prediction.ch/)預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)[8]。將上述數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果合并獲得RHD活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.4 疾病靶點(diǎn)搜集

分別以“Acute pharyngitis”“Pharyngitis”“Inflammation”為關(guān)鍵詞,通過(guò)TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/ttd/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選與急性咽炎相關(guān)的基因,獲取急性咽炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.5 RHD活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作分析,限定物種為人,獲取蛋白之間相互作用關(guān)系。取置信度0.9以上結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1進(jìn)行可視化分析,構(gòu)建“RHD活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及“疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)Cytoscape軟件將上述網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并,獲取“RHD活性成分-治療急性咽炎作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。利用Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)涮卣髦?以節(jié)點(diǎn)形狀大小描述度中心性(Degree)。

1.6 生物信息學(xué)分析

為尋找靶點(diǎn)蛋白在生物學(xué)功能及信號(hào)通路中發(fā)揮的作用,采用R語(yǔ)言對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行基因本體論分析(Gene ontology,,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,根據(jù)富集分析顯著性從中篩選出RHD治療急性咽炎可能的信號(hào)通路,并通過(guò)Pathview網(wǎng)站(https://pathview.uncc.edu/)顯示靶點(diǎn)蛋白在通路中的位置。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

基于“1.6”項(xiàng)下富集結(jié)果,對(duì)RHD活性成分及篩選出的信號(hào)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子模擬對(duì)接驗(yàn)證。通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載蒲公英賽醇(Taraxerol)、黃芩素(Baicalein)、木樨草素(Luteolin)、槲皮苷(Quercetin)晶體3D結(jié)構(gòu),使用SYBYL 2.0軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。從RCSB Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)獲得NF-κB(PDB代碼:2o61)、MAPK1(PDB代碼:4qpa)、AKT(PDB代碼:6hhh)、IKBKB(PDB代碼:4e3c)的蛋白結(jié)構(gòu),導(dǎo)入SYBYL 2.0中刪除配體和水分子從而暴露出蛋白結(jié)合活性口袋,采用Surflex-Dock(SFXC)對(duì)接模式,Surflex-Dock得分越高表示配體和受體的親和力越大。

2 結(jié)果

2.1 RHD活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)蛋白的收集與篩選

共篩選得到90個(gè)RHD中含有的活性化合物,其中有8個(gè)化合物為共有化合物。共篩選得到424個(gè)靶點(diǎn)蛋白,盡管每味藥作用靶點(diǎn)不盡相同,但有223個(gè)共同作用靶點(diǎn),提示不同組成藥物間存在著相互協(xié)同作用機(jī)制,見(jiàn)圖1。

注:A:潤(rùn)喉飲中五種藥材的活性化合物個(gè)數(shù);B:五種藥材藥活性化合物的作用靶點(diǎn)個(gè)數(shù)。

2.2 潤(rùn)喉飲“活性成分-靶點(diǎn)-治療急性咽炎”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

首先使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建RHD中424個(gè)作用靶點(diǎn)間的交互網(wǎng)絡(luò),取置信度為0.9以上的網(wǎng)絡(luò),得到潤(rùn)喉飲“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。共收集篩選得到129個(gè)急性咽炎相關(guān)靶點(diǎn),通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建129個(gè)靶點(diǎn)間的交互網(wǎng)絡(luò),取置信度為0.9以上的網(wǎng)絡(luò),獲取“急性咽炎-相關(guān)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)Cytoscape 3.7.1軟件將兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)合并,得到潤(rùn)喉飲“活性成分-靶點(diǎn)-治療急性咽炎”網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的度值表示在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)直接相互作用的節(jié)點(diǎn)的數(shù)目,節(jié)點(diǎn)的度越大則其參與的生物功能越多[9]。以大于平均Degree值為條件篩選核心網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖2。該網(wǎng)絡(luò)包含98個(gè)節(jié)點(diǎn)(包括20個(gè)活性成分和72個(gè)作用靶點(diǎn))和739條邊,靶點(diǎn)的平均Degree值為18.3,證明潤(rùn)喉飲可通過(guò)多成分與多靶點(diǎn)相互作用治療急性咽炎,其中木蝴蝶、桔梗和十大功勞中的活性成分可能發(fā)揮主要作用。

圖2 潤(rùn)喉飲“活性成分-治療急性咽炎靶點(diǎn)-作用通路”核心網(wǎng)絡(luò)

表1 潤(rùn)喉飲“活性成分-治療急性咽炎靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)核心成分、靶點(diǎn)及其拓?fù)鋮?shù)

2.3 富集分析和靶點(diǎn)映射

為進(jìn)一步明確靶點(diǎn)蛋白的生物學(xué)功能,采用R語(yǔ)言對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO注釋和富集分析。結(jié)果顯示,RHD治療急性咽炎的靶點(diǎn)蛋白主要分布于微膜結(jié)構(gòu)域(Membrane microdomain),發(fā)揮細(xì)胞因子結(jié)合功能(Cytokine receptor binding),主要影響生物體應(yīng)激進(jìn)程(Response to xenobiotic stimulus)。為明確靶點(diǎn)蛋白調(diào)控的信號(hào)通路,對(duì)其進(jìn)行KEGG富集分析。結(jié)果顯示RHD可調(diào)控Measles、AGE-RAGE、IL-17及Small cell lung cancer等信號(hào)通路,見(jiàn)圖3。由于潤(rùn)喉飲治療急性咽炎的作用與抗炎有關(guān),因此篩選與炎癥相關(guān)的IL-17信號(hào)通路,采用Pathview進(jìn)一步將靶點(diǎn)蛋白映射整合在通路上,見(jiàn)圖4。

注:展示以P值從小到大排序前5的富集條目。

圖4 IL-17信號(hào)通路

圖5 活性成分與作用靶點(diǎn)分子對(duì)接

2.4 關(guān)鍵蛋白和通路的分子模擬對(duì)接

基于通路分析及生物學(xué)注釋結(jié)果,采用分子模擬對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證并通過(guò)Discovery Studio 4.5軟件可視化,以打分結(jié)果(Total score)大于4分表示化合物與靶點(diǎn)有較好的活性[10]。

3 討論

潤(rùn)喉飲柳州市人民醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)方,實(shí)踐證明治療急性咽炎療效俱佳,但其作用機(jī)理和成分配伍缺少科學(xué)的解釋。本研究首先通過(guò)收集和篩選潤(rùn)喉飲中五種藥材已報(bào)道的活性成分及其靶點(diǎn),構(gòu)建潤(rùn)喉飲“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。共篩選和收集得到90個(gè)活性成分,其中只有8個(gè)為共有化合物,223個(gè)共同作用靶點(diǎn),提示不同組成藥物間存在著相互協(xié)同作用機(jī)制,也有自身獨(dú)特的作用方式。其中木蝴蝶的活性成分最多,壯藥十大功勞收集的活性成分較少,可能是由于木蝴蝶的成分研究結(jié)果較多而十大功勞成分研究較少所致。本研究通過(guò)將潤(rùn)喉飲“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)和急性咽炎相關(guān)“疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)合并,得到潤(rùn)喉飲治療急性咽炎的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),并通過(guò)調(diào)整度值篩選獲取核心網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中度值高的活性成分大多來(lái)源于木蝴蝶、桔梗和十大功勞,證明潤(rùn)喉飲中主要為木蝴蝶、桔梗和十大功勞發(fā)揮抗炎功效。

為進(jìn)一步了解作用靶點(diǎn)的生物學(xué)功能及調(diào)控通路,對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行功能及通路富集分析。在所有富集信號(hào)通路中,IL-17信號(hào)通路與炎癥發(fā)生相關(guān)且顯著性排名較高,因此選擇IL-17信號(hào)通路為潛在的作用通路,并將潤(rùn)喉飲中治療急性咽炎的靶點(diǎn)基因映射至該通路上,以便直觀篩選IL-17信號(hào)通路中的候選基因。結(jié)果顯示,潤(rùn)喉飲治療急性咽炎的作用可能與調(diào)控NF-κB信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路相關(guān)。NF-κB信號(hào)通路與炎癥發(fā)生密切相關(guān),在炎癥和氧化損傷的微環(huán)境下,IκK和IκB的激活可以促進(jìn)NF-κB的磷酸化,導(dǎo)致不可逆的炎癥損傷,抑制IκK/IκB/NF-κB通路的激活可被視為治療靶點(diǎn)[11-12]。作為介導(dǎo)基本生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞對(duì)外部應(yīng)激信號(hào)反應(yīng)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,MAPKs能夠調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞凋亡介質(zhì)的合成[13]。特別是,越來(lái)越多的證據(jù)表明MAPKs還參與NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)[14]。除此之外,Akt也是潤(rùn)喉飲篩選的靶點(diǎn)蛋白且在“成分-靶點(diǎn)”核心網(wǎng)絡(luò)中且度值排名靠前,研究表明,Akt是NF-κB的上游靶點(diǎn)之一[15]。因此采用分子對(duì)接技術(shù)研究槲皮苷、木樨草素、黃芩素和蒲公英賽醇及其靶點(diǎn)MAPK1、AKT、NF-κB1、IKBKB的對(duì)接方式,以對(duì)接分?jǐn)?shù)判斷受體與配體間的親和力,得分大于4分表示與受體有較好結(jié)合活性。結(jié)果顯示,木蝴蝶和十大功勞的共有成分槲皮苷與MAPK1蛋白對(duì)接分?jǐn)?shù)為5.18分,與AKT蛋白對(duì)接分?jǐn)?shù)為3.88分,表示槲皮苷可能與MAPK1有相互作用。桔梗的活性成分木樨草素與AKT蛋白對(duì)接分?jǐn)?shù)為5.93分,與MAPK1蛋白對(duì)接分?jǐn)?shù)為5.99分,提示木樨草素可能同時(shí)激活A(yù)KT蛋白和MAPK1蛋白,抑制下游的炎癥因子合成。源自木蝴蝶的黃芩素與NF-κB上游蛋白IKBKB對(duì)接分?jǐn)?shù)為4.27分,來(lái)源于淡竹葉的蒲公英賽醇與NF-κB蛋白對(duì)接分?jǐn)?shù)僅3.21分,提示蒲公英賽醇與NF-κB可能對(duì)接活性較差,還需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。綜上,分子對(duì)接結(jié)果大部分驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)論,潤(rùn)喉飲可能通過(guò)調(diào)控AKT/IKBKB/NF-κB與MAPK1/AP-1信號(hào)通路抑制炎癥因子表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)柳州市人民醫(yī)院制劑壯藥潤(rùn)喉飲治療急性咽炎的潛在機(jī)制可能通過(guò)調(diào)控AKT/IKBKB/NF-κB與MAPK1/AP-1信號(hào)通路抑制炎癥因子的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用。其中壯藥十大功勞、木蝴蝶及桔梗發(fā)揮抗炎的主要作用,潤(rùn)喉飲配方具有一定的藥用價(jià)值,獲得的關(guān)鍵靶標(biāo)及具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究加以探索及驗(yàn)證,本研究初步揭示了壯藥潤(rùn)喉飲治療急性咽炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)及作用機(jī)制,為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。