羅洪蓮,萬紅才

(黔南州檢驗檢測院,貴州 都勻 558000)

骨碎補(bǔ)藥材為水龍骨科植物槲蕨Drynariafortunei(Kunze)J.Sm.的干燥根莖,又名崖姜、胡孫姜、巖連姜、石毛姜、爬巖姜、石碎補(bǔ),具有療傷止痛、補(bǔ)腎強(qiáng)骨的功效,外用可消風(fēng)祛斑[1]。因功效明確,藥效甚好,骨碎補(bǔ)的開發(fā)與利用,從藥用領(lǐng)域延伸至保健食品領(lǐng)域,民間常見制成酒劑或顆粒、膠囊等長期服用以防治骨質(zhì)疏松、腰酸背痛、耳鳴耳聾。但由于受到生長環(huán)境(工業(yè)污染)、炮制加工方法(砂燙法)的影響,再加上屬根莖類藥材[2],骨碎補(bǔ)重金屬污染問題不容忽視。但在《中華人民共和國藥典》2020年版一部骨碎補(bǔ)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中,未列入重金屬檢測項目[1]。為避免藥材殘留的重金屬在人體內(nèi)蓄積產(chǎn)生毒性,應(yīng)對骨碎補(bǔ)藥材中殘留的重金屬進(jìn)行評估控制?，F(xiàn)對骨碎補(bǔ)藥材的殘留重金屬檢測做探索試驗,并進(jìn)行方法學(xué)驗證,最終建立適宜的檢測方法對骨碎補(bǔ)藥材的殘留重金屬進(jìn)行測定,為骨碎補(bǔ)藥材的質(zhì)量控制提供有效依據(jù)。

1 實驗器材

1.1 儀器

十萬分之一電子天平(梅特勒托利多公司,型號:XSE105DU型);微波消解儀(安東帕公司,奧地利,型號:ETHOS VB24UP型);冷水循環(huán)機(jī)(安捷倫公司,美國,型號:G3292A型);激光冷水機(jī)(安捷倫公司,美國,型號:PH-LW16-BHP型);趕酸儀(北京萊伯泰科儀器股份有限公司,型號:VB24VP型);電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(安捷倫公司,美國,型號:7800型)。

1.2 試藥

Cu、As、Cd、Hg、Pb混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(批號:21D1376,1 000μg·mL-1),鍺(Ge)、銦(In)、鉍(Bi)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(批號:21D1375,100μg·mL-1),金(Au)元素(批號:211033-1,1 000μg·mL-1),均購于國家有色金屬及電子材料分析中心;黃芪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(地球物理地球化學(xué)勘查研究所,GBW10028,批號:200702);調(diào)諧液(7Li、59Co、89Y、140Ce、205Tl)(安捷倫公司,美國,1μg·L-1);硝酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:20014508,優(yōu)級純);純凈水(貴陽娃哈哈飲料有限公司,批號:20190629)。

1.3 樣品

骨碎補(bǔ)樣品3批購買于藥店,1批購買于醫(yī)院,其余9批采集自貴州各地,采集樣品經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院魏升華教授鑒定均為水龍骨科植物槲蕨Drynariafortunei(Kunze)J.Sm.的干燥根莖。樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器測定參數(shù)設(shè)置

射頻功率1 500W;載氣體積流量0.8L·min-1;霧化氣體積流量14L·min-1;輔助氣體積流量0.8L·min-1;蠕動泵轉(zhuǎn)速25r·min-1;采樣模式全定量;穩(wěn)定時間50s;測定時間40s;采樣深度8mm;采樣點3次;循環(huán)水溫度15～20℃;循環(huán)水壓力230～400kPa。使用調(diào)諧液調(diào)整儀器至最佳就緒狀態(tài)后,依次吸取2%硝酸溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白溶液、樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)控樣品溶液,同步吸取內(nèi)標(biāo)溶液[3-4],按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則2321、0412中ICP-MS法進(jìn)行測定,待測元素選取的同位素為63Cu、75As、114Cd、202Hg和208Pb,其中63Cu、75As以72Ge作為內(nèi)標(biāo),114Cd以115In作為內(nèi)標(biāo),202Hg、208Pb以209Bi作為內(nèi)標(biāo)[5]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

2.2.1 金元素標(biāo)準(zhǔn)溶液 取金元素標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量,純凈水稀釋制成500ng·mL-1,即得。

2.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密量取Cu、As、Cd、Hg、Pb混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量,用純凈水制成濃度為1 000ng·mL-1的貯備液,再精密量取該貯備液及“2.2.1”項下金元素貯備液適量,用2%硝酸稀釋制成每1mL中含金元素5ng的各重金屬濃度分別為0、0.4、0.8、2、4、8、20、40、80、200ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,即得。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液 精密量取含100μg·mL-1Ge、In、Bi單元素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,2%硝酸稀釋制成4ng·mL-1,即得。

2.3 供試品溶液制備

取供試樣品(過3號篩)約0.5g,精密稱定,置聚四氟乙烯消解罐中,加硝酸10mL,置于趕酸儀中80℃保溫1h,旋緊上蓋,置微波消解儀消解,消解程序見表2。消解完畢后冷卻至室溫,打開上蓋,置趕酸儀上,于120℃下趕酸至約1mL,轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中,用純凈水多次洗滌消解罐,洗液并入量瓶中,加入“2.2.1”項下金元素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL,用純凈水稀釋至刻度,搖勻,用孔徑0.45μm的微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液,同法制備空白溶液10份(空白溶液不加“2.2.1”項下金元素標(biāo)準(zhǔn)溶液)[6-7]。

表2 微波消解程序

用調(diào)諧液將ICP-MS調(diào)至最優(yōu)就緒狀態(tài),取“2.2”項下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、內(nèi)標(biāo)溶液及空白溶液,分別以待測元素響應(yīng)值與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)元素響應(yīng)值之比率為縱坐標(biāo)(Y),相應(yīng)元素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)線性回歸,結(jié)果見表3,表明各元素在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 待測元素線性、檢測限、定量限

2.4 檢測限與定量限的測定

檢測限與定量限的測定參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0412檢測限與定量限測定方法,取“2.3”項方法制備的10份空白溶液測定Cu、As、Cd、Hg、Pb響應(yīng)值(CPS),計算各元素CPS標(biāo)準(zhǔn)偏差(Standarddeviation,SD)值,以3SD值作為檢測限,10SD值作為定量限。即得Cu、As、Cd、Hg、Pb的檢測限與定量限[8-10]。結(jié)果見表3。

2.5 精密度、重復(fù)性試驗

取含Cu、As、Cd、Hg、Pb的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(40ng·mL-1),連續(xù)進(jìn)樣6次,測得Cu、As、Cd、Hg、Pb濃度的RSD分別為1.9%、1.9%、2.6%、2.3%、2.7%,表明儀器精密度良好,滿足測定條件;平行稱取樣品(S1)6份,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,測定樣品中Cu、As、Cd、Hg、Pb的濃度RSD分別為2.2%、3.1%、2.1%、1.6%、2.0%,表明該樣品測定方法重復(fù)性良好。

2.6 回收率試驗

平行稱樣品(S1)9份,分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度均為50ng·mL-1)1.00、2.00、3.00mL,按“2.3”項方法制備低、中、高三個不同濃度級的供試品溶液;按“2.1”設(shè)置儀器條件測定9份樣品中各元素的濃度,計算待測元素回收率見表4。

表4 測定元素加樣回收試驗結(jié)果 (n=9)

2.7 準(zhǔn)確度試驗

取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)黃芪,按“2.3”項下方法制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)控樣品溶液,按“2.1”項設(shè)定儀器參數(shù)測定其中各目標(biāo)元素質(zhì)量濃度含量,再與“黃芪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)認(rèn)定證書”中“生物成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)認(rèn)定值與不確定度”的參考值進(jìn)行比較,結(jié)果見表5。由此可知,5 種元素的測定值均在參考值范圍內(nèi),證實該測定方法可信。

表5 黃芪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中各元素的測定值與參考值 (n=3,mg·kg-1)

2.8 待測元素含量測定

按“2.3”項方法制備供試品溶液,每批樣品平行制樣3份,按“2.1”項設(shè)定儀器參數(shù)測定各元素質(zhì)量濃度含量,見表6。

表6 13批骨碎補(bǔ)藥材中5種重金屬元素的含量濃度 (n=3,mg·kg-1)

2.9 重金屬污染評價

表7 骨碎補(bǔ)藥材中5種重金屬污染評價

3 討論與結(jié)論

采用ICP-MS測定中藥材中殘留重金屬,具有操作簡單,能夠消除其他元素干擾,滿足多個元素同時測定、檢出限低、靈敏度高等優(yōu)點。但待測元素中,Hg元素對測定有一定要求,Hg元素有易揮發(fā)性,在樣品處理時,采用相對溫度低、密封條件好的微波消解法,趕酸溫度設(shè)置在120℃以內(nèi),克服Hg元素易揮發(fā)、易流失的樣品處理難點,有效提高回收率,微波消解法能減少硝酸的用量,降低儀器檢測背景,縮短樣品處理耗時;Hg元素具有吸附效應(yīng),容器、儀器的泵管、進(jìn)樣管、霧化室、矩管、采樣錐等會對Hg元素產(chǎn)生吸附,易造成記憶效應(yīng)。在《中華人民共和國藥典》操作指南中,采用金元素能與Hg元素形成金汞齊,增加Hg元素的溶解性,并且能夠很好保證Hg元素的穩(wěn)定性,降低記憶效應(yīng)[14]。因此,新建方法在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液中均加入適量的金元素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為Hg元素穩(wěn)定劑,使Hg元素的測定得到保證。

建立對骨碎補(bǔ)藥材中的5種殘留重金屬元素測定方法,在0～200ng·mL-1濃度范圍內(nèi),線性(R≥0.999 6)、回收率(95.7%～101.1%)、精密度(RSD≤2.7%)、重復(fù)性(RSD≤3.1%),結(jié)果均符合《中華人民共和國藥典》2020版四部規(guī)定[9]。在《中國藥品檢驗操作標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》中提到,采用具有法定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書且基質(zhì)與所測藥材類似的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可驗證方法的可靠性[15],故選用同為根莖類藥材黃芪成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),采用上述方法測定其中各重金屬的含量,測定結(jié)果與認(rèn)定值(參考值)一致,表明該方法準(zhǔn)確可靠。通過對13批骨碎補(bǔ)藥材中殘留重金屬定量分析,參照限度較嚴(yán)的《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定,13 批樣品中,Cd超標(biāo)樣品占總數(shù)的53.8%,含有量為標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定值的1.1～2.9倍;其他元素及各元素總量均值限度值內(nèi)。其中4批超出Cd元素限度近3倍,骨碎補(bǔ)藥材炮制過程中砂燙是否是Cd元素污染嚴(yán)重的誘因之一,可進(jìn)一步探討。

采用單因子指數(shù)法及內(nèi)梅羅綜合指數(shù)法評價骨碎補(bǔ)藥材重金屬污染的情況,發(fā)現(xiàn)采集的13批藥材中,8批藥材中Cd元素單因子指數(shù)超標(biāo),綜合指數(shù)來看,2批中度污染,1批輕度污染,4批接近安全警戒。從分析數(shù)據(jù)可知,樣品中Cd、Pb元素含有量波動大,建議重點監(jiān)控骨碎補(bǔ)中Cd、Pb元素的含有量。