皮鳳娟,劉輝揚,王 杰,陳婧林,皮 超,魏郁夢*

(1.瀘州市中醫(yī)醫(yī)院,四川 瀘州 646000;2.西南醫(yī)科大學 藥學院,四川 瀘州 646000)

炎癥是生物進化過程中逐漸形成的一種抵御外來病原體入侵的保護機制,是機體受到抗原刺激后所產(chǎn)生的免疫反應,其反應與免疫細胞、細胞因子及相關(guān)信號通路等密切相關(guān)[1]。炎癥根據(jù)病程長短,一般可分為急性炎癥與慢性炎癥。急性炎癥是機體受到有害刺激而發(fā)生的一個復雜的反應,常伴隨著多條信號通路的啟動,以及炎性介質(zhì)的釋放,可引起腫脹、疼痛等癥狀;如果控制不及時,就會逐漸轉(zhuǎn)化為慢性炎癥,對機體造成嚴重損害[2]。

硝礬洗劑是四川省瀘州市中醫(yī)醫(yī)院(以下簡稱“我院”)的臨床協(xié)定方,是我院根據(jù)臨床經(jīng)驗用藥研制而成,由大黃、芒硝、黃柏和蒼術(shù)等組成[3]。該制劑具有清熱解毒、消腫止痛及收濕止癢的作用,可發(fā)揮良好的抗炎效果,臨床一般將其原液稀釋1～2倍使用,療效顯著且不良反應較小,但其抗炎作用機制尚不清楚。因此,本研究設計了醋酸致小鼠扭體、二甲苯致小鼠耳腫、角叉菜膠致大鼠足腫脹3種急性炎癥模型來觀察硝礬洗劑抗炎作用效果并探討其作用機制,為其臨床應用及進一步開發(fā)研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級昆明(KM)小鼠72只,雌雄各半,平均體質(zhì)量為(23±2)g,由西南醫(yī)科大學動物中心提供,生產(chǎn)許可證為:SCXK(川)2018-17。SPF級SD大鼠36只,雌雄各半,平均體質(zhì)量為(170±10)g,由西南醫(yī)科大學動物中心提供,生產(chǎn)許可證為:SCXK(川)2018-17。所有動物在室溫20～26 ℃,相對濕度40%～70%的環(huán)境中培養(yǎng),實驗開始前需適應性培養(yǎng)5～7 d,自由進食和飲水。動物使用許可證號:SYXK(川)2018-065。

1.2 藥物

硝礬洗劑(四川省瀘州市中醫(yī)醫(yī)院自制,批號:20210502、20210501);潔爾陰洗液(四川恩威制藥有限公司,批號:2108106)。

1.3 試劑與儀器

硫化鈉(成都市科龍化工試劑廠,批號:20120901);氯化鈉(成都市科隆化學品有限公司,批號:2022012401);冰醋酸(成都市科隆化學品有限公司,批號:2021061601);二甲苯(成都市科隆化學品有限公司,批號:2021110501);角叉菜膠(上海源葉生物科技有限公司,批號:A03GS156673);小鼠cAMP試劑盒(武漢力博瑞生物科技有限公司,批號:202202);小鼠PGE2、IL-1β、TNF-α試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司,批號均為:202202);大鼠PGE2、IL-1β試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司,批號分別為:202203、202202);PV-200足趾容積測量儀(成都泰盟軟件有限公司);5424R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);Bio Tek Cytation3酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 抗醋酸致KM小鼠扭體實驗 取KM小鼠36只,雌雄各半,用8%的硫化鈉溶液在每只小鼠腹部同一部位各脫毛2cm×3cm。將小鼠隨機分為6組:空白組(不給予任何處理,正常飲食)、模型組(給予生理鹽水)、陽性組(10%潔爾陰洗液)和硝礬洗劑低(原液稀釋兩倍)、中(原液稀釋一倍)、高(原液)3個濃度組,每組6只。脫毛24h后,根據(jù)人體與動物的每公斤體質(zhì)量濃度折算系數(shù)表,分別在模型組涂抹適量的生理鹽水(75mL/kg),在陽性組(9mL/kg)和低、中、高3個濃度組(75mL/kg)的脫毛區(qū)涂抹相應藥物,均為2次/d,連續(xù)給藥3d。末次給藥30min后[4],小鼠(空白組除外)腹腔注射0.8%醋酸溶液致痛(10mL/kg)。記錄小鼠15min內(nèi)的扭體次數(shù),并按公式(1)計算各組的鎮(zhèn)痛率[5]。

(1)

1.4.2 抗二甲苯致KM小鼠耳腫脹實驗 取KM小鼠36只,雌雄各半。分組方法同“2.1”項下,分別在模型組涂抹適量的生理鹽水(75mL/kg),在陽性組(9mL/kg)和硝礬洗劑低、中、高3個濃度組(75mL/kg)的小鼠右耳廓正反面涂抹相應藥物,均為2次/d,連續(xù)給藥5d。末次給藥1h后,精密吸取二甲苯(1mL/kg)均勻涂于小鼠(空白組除外)右耳正反兩面,左耳不涂作為對照[6]。二甲苯涂耳30min后,取血1mL,頸椎脫臼處死。全血靜置30min,3 000rpm離心10min,取上層血清,置于4℃冰箱中冷藏,備用[7]。最后,采用6mm打孔器分別于左右耳對稱部位打下耳片,稱量各鼠耳片質(zhì)量,并按公式(2)(3)計算腫脹度和抑制率[8]。

腫脹度=(右耳片重-左耳片重)

(2)

(3)

1.4.3 抗角叉菜膠致SD大鼠足底腫脹實驗 取SD大鼠36只,雌雄各半。分組方法同“2.1”項下,分別讓模型組浸泡生理鹽水(75mL/kg)15min,讓陽性組(9mL/kg)和硝礬洗劑低、中、高3個濃度組(75mL/kg)的大鼠右腳浸泡相應藥物15min,均為2次/d,連續(xù)給藥5d。結(jié)束給藥1h后,用足容積測量儀測量大鼠(空白組除外)右后足容積,連續(xù)3次,取均值。然后,在大鼠足底中部皮下注射1%角叉菜膠混懸液0.1mL/只,建立足腫脹模型[9]。用足容積測量儀測量造模后0、0.5、1、2、3、4、5h右后肢足容積,連續(xù)3次,取均值。按公式(4)計算平均腫脹度。

平均腫脹度=(造模后右后足容積均值-給藥后后足容積均值)

(4)

1.4.4 對醋酸致痛KM小鼠血清中cAMP含量的影響 對“1.2.1”項下考察完扭體反應的小鼠,取血1mL,頸椎脫臼處死。全血靜置30min,3 000rpm離心10min,取上層血清,置于4℃冰箱中冷藏,備用[7]。按照試劑盒說明書操作,測定血清中cAMP含量。

1.4.5 對二甲苯致耳腫脹KM小鼠血清中PGE2、IL-1β、TNF-α含量的影響 對“1.2.2”項下制得的血清,按照試劑盒說明書操作,分別測定血清中PGE2、IL-1β、TNF-α的含量。

1.4.6 對角叉菜膠致足腫脹SD大鼠血清中PGE2、IL-1β含量的影響 考察“1.2.3”項下完足腫脹的大鼠,取血1mL,頸椎脫臼處死。全血靜置30min,3 000rpm離心10min,取上層血清,置于4℃冰箱中冷藏,備用[7]。按照試劑盒說明書操作,分別測定血清中PGE2、IL-1β的含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 對醋酸致KM小鼠扭體的影響

與模型組相比,硝礬洗劑各濃度組均能顯著降低小鼠扭體次數(shù)(P<0.01)。且硝礬洗劑中、高濃度組降低小鼠扭體次數(shù)的效果優(yōu)于陽性組。此外,硝礬洗劑中、高濃度組小鼠扭體次數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 對醋酸致KM小鼠扭體影響

2.2 對二甲苯致KM小鼠耳腫脹的影響

與模型組相比,硝礬洗劑各濃度組均能顯著降低小鼠耳腫脹度(P<0.05)。且硝礬洗劑中、高濃度組降低小鼠耳腫脹度的效果優(yōu)于陽性組。此外,硝礬洗劑中、高濃度組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 對二甲苯致KM小鼠耳腫脹的影響

2.3 對角叉菜膠致SD大鼠足腫脹的影響

與模型組相比,陽性組和硝礬洗劑各濃度組的足腫脹度在致炎2h后基本均有不同程度的降低,其中,陽性組的足腫脹度在致炎2、3、4h后與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),硝礬洗劑低、中、高濃度組的足腫脹度在致炎5h后比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。此外,硝礬洗劑中、高濃度組的足腫脹度在致炎后各時間點比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 對角叉菜膠致SD大鼠足腫脹的影響

2.4 對醋酸致痛KM小鼠血清中cAMP含量的影響

與模型組相比,硝礬洗劑各濃度組均能降低小鼠血清中cAMP含量,其中,中、高濃度組與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。硝礬洗劑高濃度組降低的效果顯著優(yōu)于陽性組(P<0.05)。此外,硝礬洗劑中、高濃度組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 對醋酸致痛KM小鼠血清中cAMP含量的影響

2.5 對二甲苯致耳腫脹KM小鼠血清中PGE2、IL-1β、TNF-α含量的影響

與模型組相比,硝礬洗劑各濃度組能降低小鼠血清中PGE2、IL-1β、TNF-α的含量,且所有中、高濃度組的血清指標比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。中、高濃度組的PGE2和高濃度組的TNF-α降低的效果顯著優(yōu)于陽性組(P<0.05)。此外,硝礬洗劑中、高濃度組的各指標比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 對二甲苯致耳腫脹KM小鼠血清中PGE2、IL-1β、TNF-α含量的影響

2.6 對角叉菜膠致足腫脹SD大鼠血清中PGE2、IL-1β含量的影響

與模型組比較,硝礬洗劑各濃度組均能降低大鼠血清中PGE2、IL-1β的含量,其中,高濃度組PGE2與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。硝礬洗劑高濃度組PGE2降低的效果顯著優(yōu)于陽性組(P<0.05)。此外,硝礬洗劑中、高濃度組PGE2、IL-1β比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 對角叉菜膠致足腫脹SD大鼠血清中PGE2、IL-1β含量的影響

3 討論

硝礬洗劑中的主要成分大黃、芒硝、黃柏和蒼術(shù)等具有明顯的抗炎、抗水腫及鎮(zhèn)痛作用。本研究結(jié)果表明,硝礬洗劑能有效減少小鼠扭體次數(shù),可能是處方中含有的大黃、芒硝具有良好的鎮(zhèn)痛效果[10-11]。此外,硝礬洗劑還能有效抑制小鼠耳腫脹程度和大鼠足腫脹程度,可能與處方中含有的芒硝和蒼術(shù)有關(guān)[11-12]。角叉菜膠誘導的足腫脹涉及兩個階段,第一個階段(0～2h)的腫脹可能與5-羥色胺等炎性介質(zhì)含量增加有關(guān);第二個階段(2h以后)可能與前列腺素等炎性介質(zhì)含量增加有關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示,潔爾陰洗液能抑制角叉菜膠誘導的足腫脹第一階段,但對第二階段的作用逐漸減弱;硝礬洗劑在致炎3h后才逐漸發(fā)揮作用,主要作用于足腫脹的第二階段,推測硝礬洗劑的抗炎作用機制與促使前列腺素的含量降低有關(guān)。該推測與本研究中檢測的血清PGE2結(jié)果相符。

當炎癥發(fā)生時,免疫細胞會分泌PGE2、IL-1β和TNF-α等炎性介質(zhì),若適量則可發(fā)揮保護機體的作用,而過量的炎性介質(zhì)會反作用于細胞,發(fā)生級聯(lián)反應,進而引發(fā)嚴重的炎癥反應甚至危及生命[14-15]。本研究結(jié)果表明,硝礬洗劑可降低血清中cAMP、PGE2、IL-1β、TNF-α的含量。cAMP是細胞內(nèi)重要的第二信使分子,霍桂桃等[16]發(fā)現(xiàn),細胞內(nèi)cAMP含量升高可抑制Toll樣受體2/4(TLR2/4)的表達,進而抑制NF-κB的活性,最終減少促炎因子釋放,研究表明,硝礬洗劑中含有的大黃和黃柏皮發(fā)揮抗炎作用的機制即基于抑制NF-κB的活化[17-18]。PGE2過量會引起水腫、炎性疼痛等反應,其含量降低可能與蒼術(shù)有關(guān)[19]。IL-1β可促進PGE2表達,TNF-α與受體結(jié)合后可激活NF-κB,從而誘導促炎因子產(chǎn)生[2]。綜上,硝礬洗劑是通過降低血清中cAMP含量,從而抑制NF-κB的活性,進而使得血清中PGE2、IL-1β、TNF-α等炎癥介質(zhì)含量下降,最終發(fā)揮抗炎作用。且硝礬洗劑發(fā)揮抗炎作用呈濃度相關(guān)性,低、中濃度組即可產(chǎn)生良好的效果,中濃度組抗炎效果尤為顯著;高濃度組抗炎效果太顯著,各血清指標下降太劇烈,遠低于正常組,且中、高濃度組各血清指標比較,差異無統(tǒng)計學意義。因此,硝礬洗劑低、中濃度用于抗炎較為合適,其臨床用量具有合理性。

綜上,硝礬洗劑具有良好的抗炎效果,其作用機制可能與血清中cAMP、PGE2、IL-1β、TNF-α的含量下降有關(guān)。此外,本研究為硝礬洗劑的臨床應用提供了實驗依據(jù),驗證了其臨床用量的合理性,選擇將原液稀釋一倍使用,也為進一步研究其作用機制提供參考。