劉 茜

（貴陽(yáng)康養(yǎng)職業(yè)大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550001）

近年來(lái)隨著我國(guó)人口老齡化速度的加快，各類(lèi)基礎(chǔ)疾病的發(fā)病率均逐年增加，其中就包括腎病[1]。目前，臨床上一般是對(duì)腎組織樣本實(shí)施冰凍切片免疫熒光染色診斷或石蠟切片免疫熒光染色診斷，或?qū)⒍呗?lián)合應(yīng)用。臨床一般認(rèn)為冰凍切片免疫熒光染色法的診斷效果相對(duì)較佳，但也存在一定不足，如該方法對(duì)于檢測(cè)樣本的要求苛刻，在運(yùn)輸、保存等環(huán)節(jié)稍有不慎就可影響最終的診斷結(jié)果（哪怕只是溫度稍高即可造成影響）[2]。另外，冰凍組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰度、完整性也欠佳，在某些情況下一個(gè)樣本可以得出多個(gè)互相矛盾的診斷結(jié)果。而石蠟切片則是臨床上為改善冰凍切片進(jìn)行的一種嘗試。早期臨床認(rèn)為基于福爾馬林固定的石蠟切片不適合開(kāi)展免疫熒光染色，因?yàn)樵诠潭ǖ倪^(guò)程二價(jià)鈣離子與其他二價(jià)離子會(huì)影響抗原，可能使抗原無(wú)法充分暴露，導(dǎo)致免疫熒光特異性減弱[3]。因此，在早期石蠟切片固定并不被作為活檢的主要手段，其更多的是輔助冰凍切片方案進(jìn)行更高精度的診斷，盡管研究證實(shí)兩種方案的效能相近[4]。近年來(lái)隨著針對(duì)免疫熒光染色法的進(jìn)一步研究，一些新的、特殊的染色方案被提出，石蠟切片造成的免疫熒光特異性減弱的問(wèn)題得以改善，理論上其可以提供更為有效的診斷效能?；诖耍狙芯恳?021 年1 月至2022 年12 月進(jìn)行病理學(xué)腎組織活檢的83 例患者為研究對(duì)象，探討腎活檢組織病理診斷中應(yīng)用新式石蠟切片免疫熒光染色法的可行性與效能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究開(kāi)展的時(shí)間為2021 年1 月至2022 年12 月，共納入83 份腎組織樣本，其中10 份來(lái)源于貴州電力醫(yī)院，73 份來(lái)源于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院。對(duì)全部樣本均實(shí)施常規(guī)冰凍切片免疫熒光染色診斷與新式石蠟切片免疫熒光染色診斷，將前者列為冰凍組，將后者列為石蠟組。83 份腎組織樣本來(lái)源于83 例患者，其中男51 例，女32 例，年齡范圍45 ～68 歲，均值（55.31±3.96）歲；其中膜性腎病23 例，狼瘡性腎病30 例，IgA 腎病30 例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料完整，并簽署知情同意書(shū)；（2）經(jīng)耐受性評(píng)估符合腎穿刺活檢指征。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在認(rèn)知功能障礙或合并精神疾病；（2）合并嚴(yán)重感染，或伴有其他置管支持治療措施，如維持性血液透析；（3）存在嚴(yán)重的肝、腎功能障礙；（4）不耐受腎穿刺活檢或拒絕行腎穿刺活檢。

1.2 方法

1.2.1 冰凍切片免疫熒光染色 對(duì)腎組織進(jìn)行OCT 包埋，然后采用冰凍切片機(jī)切片，厚度為5 μm，干燥3 min 后保存。轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，在標(biāo)本中加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的兔抗人作為一抗，包括免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）及補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C1q。將切片置于濕盒內(nèi)，在37 ℃的恒溫水浴鍋中孵育45 ～60 min。用磷酸鹽緩沖液浸洗5 min，反復(fù)浸洗3 次，最后直接進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

1.2.2 石蠟切片免疫熒光染色 對(duì)腎組織進(jìn)行常規(guī)處理后使用3- 氨丙基-3- 乙氧基甲硅烷處理，預(yù)防脫片。脫蠟至水（2 次，單次20 min）后實(shí)施抗原修復(fù)，使用酸堿度為6.0 的檸檬酸為緩沖液，行微波加熱修復(fù)，冷卻為室溫后實(shí)施胰酶消化。置于37 ℃的恒溫水鍋內(nèi)消化15 min，然后配置六胺銀染色，材料為：50 mL硼砂溶液+ 六次甲基四胺銀粉劑。染色：將溶液放置于62 ℃溫水箱中預(yù)熱，將石蠟樣本放入62 ℃六胺銀中30 min，持續(xù)恒溫下切片，出現(xiàn)黑色反應(yīng)后撈出。采用蒸餾水沖洗，以硫代硫酸鈉溶液處理3 min 后沖洗，采用Mayer 蘇木素染液（上海虹橋試劑）染色5 min，沖洗3 min 后行脫水處理。以伊紅染液（上海虹橋試劑）染色1 min，梯度酒精脫水，以二甲苯（天津市化學(xué)試劑供銷(xiāo)公司）為透明劑，用中性樹(shù)膠封固，后觀察確認(rèn)IgA、IgG、IgM 及補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C1q 的陽(yáng)性情況。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察并統(tǒng)計(jì)兩種診斷方式對(duì)膜性腎病、狼瘡性腎病、IgA 腎病患者IgA、IgM、IgG、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C1q 的陽(yáng)性檢出情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

腎病理組織活檢的陽(yáng)性檢出結(jié)果顯示，石蠟組23 例膜性腎病患者、30 例狼瘡性腎病患者和30 例IgA 腎病患者IgA、IgM、IgG、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C1q 的陽(yáng)性檢出率均高于冰凍組，但兩組僅在膜性腎病患者IgA、狼瘡性腎病患者IgA、IgG、補(bǔ)體C1q 的檢出率方面存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其他組間對(duì)比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 兩種診斷方式診斷結(jié)果的比較[例（%）]

3 討論

腎病在臨床上的發(fā)生率較高，且此類(lèi)疾病的診治較為復(fù)雜，有超過(guò)半數(shù)的患者病情會(huì)持續(xù)進(jìn)展[5]。這就需要臨床準(zhǔn)確判斷腎病患者的疾病類(lèi)型，以及其免疫反應(yīng)的情況，實(shí)現(xiàn)明確診斷，以便及早開(kāi)展針對(duì)性治療，延緩患者病情的發(fā)展。由于腎病主要是腎小球、腎微血管及其他細(xì)微組織受損，因此影像學(xué)診斷的效果較差。此外，腎功能損傷又是一個(gè)緩慢的過(guò)程，因此早期通過(guò)生化標(biāo)志物檢測(cè)進(jìn)行診斷的效果也一般?；诖?，病理學(xué)診斷成為當(dāng)下腎病最為準(zhǔn)確的診斷方案。但由于腎組織的特殊性，加之其主要是通過(guò)觀察免疫球蛋白等物質(zhì)來(lái)進(jìn)行疾病類(lèi)型的鑒別與嚴(yán)重程度的判斷，以及當(dāng)下較為常用的冰凍切片免疫熒光染色法本身存在的缺陷，導(dǎo)致實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中病理學(xué)診斷仍然存在一定的不足[6]。石蠟切片免疫熒光染色法并不是針對(duì)腎活檢病理學(xué)診斷的新方案，其發(fā)明已有較長(zhǎng)時(shí)間，但臨床認(rèn)為石蠟固定樣本會(huì)造成抗原封閉的問(wèn)題，因此存在一定的局限性。近年來(lái)隨著抗原修復(fù)技術(shù)的發(fā)展，已逐漸解決了石蠟固定導(dǎo)致抗原封閉的不足。目前，臨床上常用的抗原修復(fù)方案包括微波、高壓等，效果均較佳。另一問(wèn)題是，石蠟固定會(huì)造成切片的非特異性熒光染色存在缺陷，易出現(xiàn)背景染色的現(xiàn)象，這是因?yàn)槟壳皩?duì)于石蠟脫蠟的時(shí)間沒(méi)有定論。但隨著大量實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，逐漸發(fā)現(xiàn)二次脫蠟以及20 min 左右的脫蠟時(shí)間較為理想，同時(shí)新式染色法也彌補(bǔ)了染色缺陷、背景染色的問(wèn)題。得益于石蠟切片可以很好地保存組織結(jié)構(gòu)，使其呈現(xiàn)較高的清晰度，因此理論上新式石蠟切片免疫熒光染色法的效能應(yīng)該優(yōu)于一般冰凍切片免疫熒光染色法。本研究結(jié)果顯示，石蠟組23 例膜性腎病患者、30 例狼瘡性腎病患者和30 例IgA 腎病患者IgA、IgM、IgG、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C1q 的陽(yáng)性檢出率均高于冰凍組，但兩組僅在膜性腎病患者IgA、狼瘡性腎病患者IgA、IgG、補(bǔ)體C1q 的檢出率方面存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其他組間對(duì)比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。該結(jié)果符合上述觀點(diǎn)。筆者猜測(cè)導(dǎo)致該結(jié)果出現(xiàn)的原因主要有兩點(diǎn)：一是行腎組織穿刺活檢時(shí)，為了減輕損傷，一般只會(huì)采集較小的樣本，傳統(tǒng)冰凍切片免疫熒光染色法受制于各種因素的影響，只能觀察一個(gè)或幾個(gè)腎小球，并不能很好地判斷腎組織的具體情況，且冰凍切片必須在穿刺后的一定時(shí)間內(nèi)完成，否則樣本就會(huì)發(fā)生自溶，實(shí)際上處理樣本的時(shí)間可能不足；二是新式石蠟切片免疫熒光染色法可以觀察腎小球系膜區(qū)域，了解基膜的變化，理論上觀察范圍與角度均大于傳統(tǒng)冰凍切片免疫熒光染色法，另外石蠟切片可以很好地保存組織結(jié)構(gòu)，降低觀察的難度，提高觀察的準(zhǔn)確性。

綜上所述，在腎病患者腎組織病理活檢診斷中，新式石蠟切片免疫熒光染色法的診斷效能優(yōu)于傳統(tǒng)冰凍切片免疫熒光染色法，有助于更為準(zhǔn)確地檢出不同類(lèi)型的腎病，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。