熱孜萬姑麗·亞森, 買熱拍提·買明, 李晨曦,3, 龔忠誠

(1新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院(附屬口腔醫(yī)院)頜面腫瘤外科, 2新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學研究所, 烏魯木齊 830054;3口腔頜面發(fā)育與再生湖北省重點實驗室, 武漢 430022)

口腔鱗狀細胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,具有高的異質性、復發(fā)率、轉移率及侵襲率[1]。2020年,全球范圍新增OSCC病例377 713例,其中死亡病例177 757例,經過標準化治療后,患者5年生存率約為50%,復發(fā)率高達18%～76%[2]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是一種革蘭氏陰性專性厭氧菌,具有很強的黏附性,與牙周炎關系最為密切[3]。大量研究表明慢性炎癥與癌癥的關系,如幽門螺旋桿菌感染與胃癌[4],人乳頭瘤病毒感染與宮頸癌[5],EB病毒感染與鼻咽癌[6],乙型肝炎病毒感染與肝癌[7]以及牙齦卟啉單胞菌感染與口腔癌[8]。在OSCC的進展過程中存在多種趨化因子及其受體,主要是CXC類趨化因子,如CXCL1、CXCL2、CXCL5等。研究表明趨化因子配體2/趨化因子受體2(CXCL2/CXCR2)作為潛在致癌因子與多種腫瘤的惡性生物學行為相關[9]。研究發(fā)現多種G蛋白在不同癌癥(結腸癌、膀胱癌和甲狀腺癌)中具有致癌作用,包括CXCL2/CXCR2信號軸的下游蛋白Gαi、Gαq、Gαs,其中最典型的是Gαi[10],故本研究用Gαi的免疫組化檢測來驗證CXCL2/CXCR2信號軸抑制劑SCH527123是否成功抑制該信號軸。P.gingivalis誘導免疫細胞產生促腫瘤的趨化因子,這些因子與腫瘤細胞的增殖、凋亡、上皮間質轉化、侵襲、轉移等相關[8]。P.gingivalis感染的OSCC腫瘤微環(huán)境中,CXCL2通過腫瘤相關中性粒細胞(Tumor-associated neutrophils,TANs)表面黏附分子CD66b和CD11b趨化TANs向促進腫瘤的N2表型分化, 從而起到促進腫瘤進展的作用[11],故本研究用CD66b來標記N2型TANs。P.gingivalis及CXCL2在OSCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制尚未完全明確。因此,在課題組前期研究的基礎上通過動物實驗來進一步探討P.gingivalis如何通過CXCL2/CXCR2軸促進口腔鱗癌的進展。

1 材料與方法

1.1 主要試劑P.gingivalis(北納生物,中國);SCC7鼠源性鱗狀細胞癌細胞株(上海富衡生物科技有限公司,中國);CXCL2/CXCR2信號軸抑制劑SCH527123(MCE公司,中國);P.gingivalis一抗(武漢戴安生物公司,中國);Anti-CXCL2、E鈣黏蛋白(E-cadherin,E-Cad)、N鈣黏蛋白(N-cadherin,N-Cad)一抗,二抗(北京博奧森公司,中國);CD66b+腫瘤相關中性粒細胞抗體ab197678一抗,(Abcam公司,英國);二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(diaminobenzidine tetrahydrochloride,DAB)顯色試劑盒(Abcam公司,英國);胎牛血清(Gbico公司,美國);小鼠CXCL2 Elisa試劑盒(江萊生物公司,中國);RPMI-1640培養(yǎng)基(Lonza 公司,美國);SYTO9 核酸染料、DAPI 細胞核染料、Mito Tracker Red細胞線粒體染料(懋康生物,中國)。實驗動物:C57BL/6小鼠(新疆醫(yī)科大學動物實驗中心,倫理審批號:IACUC20180411-13)。

1.2 方法

1.2.1 SCC7細胞的培養(yǎng) 將凍存的1 mL細胞懸液放在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入5 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1 000 r/min條件下離心5 min,棄去上清液,補加4～6 mL完全培養(yǎng)基后吹勻,將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,恒溫培養(yǎng)箱(5%CO2,37℃)內過夜,第2天換液并檢查細胞密度及貼壁情況。細胞密度達80%～90%時進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2P.gingivalis的培養(yǎng) 本實驗用的P.gingivalis菌株為ATCC33277標準菌株[11](本課題組前期研究已測序驗證),用哥倫比亞液體培養(yǎng)基和瓊脂固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。超凈工作臺內將細菌接種至哥倫比亞血瓊脂平板,將平板和厭氧產氣袋放入厭氧箱內,置于37℃恒溫箱培養(yǎng)。

1.2.3 SCC7與P.gingivalis的共培養(yǎng)及驗證細菌計數 吸取1 mL菌液至含9 mL的哥倫比亞液體培養(yǎng)基的離心管中,混勻,37℃恒溫搖床搖勻至生長對數期。酶標儀的OD=450 nm吸光值至1時,細菌濃度為1×109CFU/mL。細菌/細胞的共培養(yǎng):取生長對數期的SCC7細胞,胰蛋白酶消化后,使用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基配成細胞懸液。25 mL的培養(yǎng)瓶中接種5×106個細胞后加約5 mL完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)瓶置于細胞培養(yǎng)箱(5%CO2,37℃)中培養(yǎng)8 h,細胞貼壁后棄原培養(yǎng)基,加含2%胎牛血清的低濃度培養(yǎng)基進行培養(yǎng)12 h。感染復數(Multiply of infection,MOI)=50建立共培養(yǎng)模型[12],未加菌液作為陰性對照。激光共聚焦顯微鏡驗證共培養(yǎng)模型,用SYTO9綠色熒光標記P.gingivalis,DAPI藍色熒光標記細胞核,Mito Tracker Red紅色熒光標記線粒體。

1.2.4 C57BL/6小鼠荷瘤實驗 用C57BL/6小鼠建立荷瘤模型,用不同濃度CXCL2/CXCR2軸抑制劑干預,將40只雌性C57BL/6小鼠分為對照組(SCC7)、高劑量組(SCC7+P.gingivalis+0.20 nmol/LSCH527123)、低劑量組(SCC7+P.gingivalis+0.05 nmol/L SCH527123)和實驗組(SCC7+P.gingivalis)。細胞濃度為2×105個/皿,菌液濃度為1×109CFU/mL,以MOI=50建立共培養(yǎng)模型,腹腔麻醉后于右側頰黏膜處注射細菌細胞混合懸液200 μL[13],對照組只注射細胞懸液。高、低劑量組于第 4、8、12、16天于右側頰黏膜造模處分別注射高、低劑量的抑制劑100 μL[14]。于第10、20天兩個時間點處死小鼠,切取腫瘤組織后常規(guī)石蠟包埋,收取小鼠血液標本。用游標卡尺測瘤體的長徑a(mm)、短徑b(mm),計算瘤體體積V(mm3)。計算公式[13]為:V=1/2×a×b2。

1.2.5 小鼠腫瘤標本免疫組化實驗 常規(guī)脫蠟,抗原修復后,一抗在4℃下孵育過夜,一抗的稀釋比分別是P.gingivalis(1∶200)、CD66b+(1∶500)、CXCL2(1∶500)、E-Cad(1∶400)、N-Cad(1∶400)、Gαi(1∶200)[14],次日加辣根過氧化物酶標記二抗,DAB顯色,蘇木素復染,脫水,封片。光鏡下觀察SCC7組織染色情況,在200倍鏡下隨機選5個無重復的視野,用Image-Pro plus 6.0軟件進行光密度值分析,測量每張圖片的累積光密度值(Integrated optical denisty,IOD),陽性區(qū)域面積(Area)。結果分級標準:計算出每張圖片的平均光密度值,計算公式:平均光密度值=IOD/Area,根據平均光密度值分為陰性(-,0～0.10),弱陽性(+,0.11～0.15),陽性(++,0.16～0.20),強陽性(+++,0.21～0.30)。

1.2.6 Elisa實驗 收集小鼠血清用Elisa檢測CXCL2含量,將收集于血清分離管的全血標本4℃過夜,1 000 r/min條件下離心20 min,取上清液,按照Elisa試劑盒操作步驟,加樣,37℃溫育1 h加生物素化抗體:取出酶標板,棄去液體,每孔加入生物素化工作液100 μL,37℃溫育1 h。洗板、加酶結合物工作液:洗板3次后每孔加工作液,37℃溫育30 min。洗板、加底物:洗板5次后,每孔加入90 μL底物,37℃避光溫育15 min。加終止液:每孔加入50 μL,立即在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.3 統(tǒng)計學方法用SPSS 27.0軟件進行數據統(tǒng)計學分析,計量資料以均數±標準差表示,組間比較用單因素方差分析和t檢驗,多個均數的兩兩比較用SNK法,P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。免疫組化的實驗結果用Image-Pro plus 6.0 進行光密度值分析。用Graphad Prism 8.0軟件進行圖像制作。

2 結果

2.1 SCC7與P.gingivalis共培養(yǎng)模型的驗證激光共聚焦顯微鏡圖顯示,P.gingivalis為綠色熒光,細胞核為藍色熒光,線粒體為紅色熒光,P.gingivalis與SCC7共培養(yǎng)后可見綠色熒光標記的P.gingivalis進入SCC7細胞質中,見圖1。

注: A, 被綠色熒光標記的P.gingivalis; B,被藍色熒光標記的細胞核; C, 被紅色熒光標記的線粒體; D, P.gingivalis進入SCC7細胞質中。

2.2 C57BL/6小鼠荷瘤實驗各組小鼠分別在第10天、第20天兩個時間點處死,完整切取腫瘤組織。同一個組中,第10天與第20天的瘤體體積相比,隨著時間的延長瘤體體積增大,對照組、低劑量組、實驗組第20天的瘤體體積均大于第10天的,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),高劑量組第10天與第20天的瘤體體積相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組相比,低劑量組、實驗組的瘤體體積明顯增大,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),對照組與高劑量組瘤體體積相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。用不同劑量的CXCL2/CXCR2軸抑制劑干預時,低劑量組與實驗組相比瘤體體積縮小(P<0.05);高劑量組與實驗組相比瘤體體積明顯縮小(P<0.01),腫瘤抑制更明顯,見圖2。

注:與第10天比較, *P<0.05;與對照組比較, △P<0.05; 與實驗組比較, #P<0.05, ##P<0.01。

2.3 小鼠腫瘤組織免疫組化實驗結果Gαi在對照組和高劑量組中弱陽性表達,低劑量組中陽性表達,實驗組中強陽性表達,實驗組中的表達強于對照組、高劑量組和低劑量組(P<0.05),低劑量組與高劑量組相比差異有統(tǒng)計學意義,低劑量組中的表達強于高劑量組(P<0.05),表明CXCL2/CXCR2信號軸抑制劑SCH527123成功抑制該信號軸(圖3、4)。

注:左圖方框中的區(qū)域40×10倍鏡下觀察后是右圖。

圖4 Gαi在各組小鼠腫瘤組織中表達的平均光密度值

2.4P.gingivalis、CXCL2、CD66b+、E-cad、N-cad在各組小鼠腫瘤組織中的表達P.gingivalis在高劑量組和低劑量組中弱陽性表達,在實驗組中陽性表達,實驗組中的表達強于高劑量組和低劑量組(P<0.05)。CXCL2在對照組中陰性表達,高劑量組中弱陽性表達,低劑量組中陽性表達,實驗組中強陽性表達,CD66b+在對照組和高劑量組中陰性表達,低劑量組中弱陽性表達,實驗組中陽性表達,CD66b+、CXCL2在實驗組中的表達均強于對照組、高劑量組和低劑量組(P<0.05),低劑量組中的表達強于高劑量組(P<0.05)。N-Cad在對照組和高劑量組中弱陽性表達,低劑量組中陽性表達,實驗組中強陽性表達,實驗組中的表達強于對照組、高劑量組和低劑量組(P<0.05)。E-Cad在對照組中強陽性表達,高劑量組中陽性表達,低劑量組中弱陽性表達,實驗組中陰性表達,對照組中的表達強于實驗組、高劑量組和低劑量組(P<0.05)。P.gingivalis、CXCL2、CD66b+、N-Cad在各組中的表達趨勢基本一致,E-Cad的表達與之相反,見圖5、6。

2.5 各組小鼠血清CXCL2含量比較對照組、高劑量組、低劑量組和實驗組小鼠血清中CXCL2的含量分別為(38.11±1.06)、(62.83±1.17)、(175.68±3.88)和(612.93±1.14)pg/mL,各組間差異均有統(tǒng)計學意義(F=95.955,P=0.000)。實驗組CXCL2的含量與對照組、高劑量組、低劑量組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001);低劑量組與高劑量組相比差異有統(tǒng)計學意義,低劑量組CXCL2的含量明顯高于高劑量組(P<0.001)。

3 討論

OSCC作為口腔頜面部最常見的惡性腫瘤,常發(fā)生于唇、口腔前庭、牙齦、磨牙后區(qū)、口底、頰黏膜、舌、腭等部位?？谇粌榷ㄖ捕喾N細菌,細菌生態(tài)系統(tǒng)之間以及細菌與宿主之間存在著復雜的動態(tài)平衡,這種平衡失調時微生物尤其是P.gingivalis等優(yōu)勢菌通過釋放毒素、代謝產物來刺激局部和全身炎癥,改變宿主的免疫反應來促進OSCC的發(fā)生發(fā)展[15]。研究表明,P.gingivalis能夠長時間與發(fā)生于口腔內的腫瘤接觸,影響腫瘤細胞的上皮間質轉化、增殖、凋亡、轉移侵襲[8]。

TANs有N1、N2兩種極化的表型,N1表型抑制腫瘤,N2表型促進腫瘤。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段TANs有不同的表型,早期主要表現為N1表型,隨腫瘤的不斷進展轉型為N2表型并促進腫瘤細胞進入血管,為腫瘤細胞的生存和增殖提供有利條件,進一步促進腫瘤的侵襲轉移[16]。相關研究報道,P.gingivalis能夠招募TANs介導OSCC的進展[17]。本研究用CD66b+標記N2型TANs,免疫組化結果顯示實驗組中陽性表達,對照組中陰性表達,并與P.gingivalis的表達趨勢一致,這一結果進一步說明P.gingivalis與TANs趨化能力的相關性。

趨化因子是一種小分子分泌型蛋白,以高親和力與其受體結合,產生“受體-配體”相互作用及強烈的信號級聯(lián)反應,在腫瘤細胞的活化、分化等惡性生物學行為中起重要的作用[18]。研究表明[9],CXCL2/CXCR2信號軸與多種腫瘤的侵襲轉移等惡性生物學行為相關。CXCL2是CXC類趨化因子的成員,與其受體CXCR2結合產生促進腫瘤血管形成的趨化因子[18]。相關文獻報道,P.gingivalis能夠活化免疫細胞產生具有促進腫瘤惡性生物學行為的趨化因子(CXCL1、CXCL2、CXCL5等)[8]。本研究結果顯示小鼠血清中CXCL2的含量以實驗組中最高,其次為低劑量組,低劑量組CXCL2的含量明顯高于高劑量組。同樣免疫組化結果示,CXCL2和P.gingivalis在各組中的表達趨勢一致;荷瘤實驗進一步驗證P.gingivalis通過上調CXCL2的含量來促進腫瘤的進展,使用CXCL2/CXCR2信號軸抑制劑時腫瘤生長被抑制,瘤體縮小,高劑量組更為明顯。因此本研究在組織水平和體外實驗觀察到了相符的結論。

上皮間質轉化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是上皮細胞失去極性及細胞間的連接,轉化為間質細胞從而獲得遷移侵襲能力的過程[19]。研究證實,P.gingivalis在OSCC的進展過程中促進口腔上皮細胞向間質細胞轉化,使口腔上皮細胞喪失黏附能力,從而在腫瘤細胞的侵襲轉移,增殖等惡性細胞行為中起重要的促腫瘤作用[20]。本研究用具有典型上皮特性的E-cad和典型間質特性的N-cad來標記腫瘤進展中的EMT現象。免疫組化結果示N-Cad在各組中的表達趨勢與P.gingivalis、CXCL2、CD66b+的表達趨勢一致,而與E-Cad的表達趨勢相反,我們推測P.gingivalis通過CXCL2/CXCR2信號軸促進腫瘤EMT現象。

綜上所述,本研究通過口腔癌動物模型進一步研究了P.gingivalis、CXCL2、TANs、E-cad、N-cad在OSCC組織中的表達水平及相關性以及CXCL2/CXCR2軸抑制劑對腫瘤的抑制作用,推測P.gingivalis與CXCL2之間可能有直接或間接的作用關系,P.gingivalis可能通過CXCL2/CXCR2軸調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、上皮間質轉化、侵襲轉移等惡性細胞學行為,進一步促進OSCC的進展。目前P.gingivalis促進OSCC的機制尚未完全明確,因此P.gingivalis對OSCC及其TME中細胞的調控機制需要進一步深入研究。