龔忠誠, 買熱拍提·買明, 李晨曦, 熱孜萬姑麗·亞森

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(附屬口腔醫(yī)院) 頜面腫瘤外科, 2新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所, 烏魯木齊 830054)

1 牙齦卟啉單胞菌的主要特征

慢性感染是癌癥發(fā)展中重要的流行病學(xué)決定因素,近20%的人類惡性腫瘤與感染因子有關(guān)[1]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)的致病因素多樣,包括其自身結(jié)構(gòu)成分,如脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、菌毛、熱休克蛋白(Heat shock protein,HSP)和分泌成分,如牙齦素(gingipains)和外膜囊泡,它們刺激相鄰上皮細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子[2],包括白細(xì)胞介素(Interleukins,ILs)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α),從而促進(jìn)腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment,TME)中的炎癥反應(yīng)[3]。P.gingivalis同時是一種兼性胞內(nèi)細(xì)菌,能入侵多種宿主細(xì)胞,包括牙齦上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和神經(jīng)元[4]。研究證實P.gingivalis涉及多種系統(tǒng)性疾病[5],如心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫病、呼吸系統(tǒng)疾病、代謝性疾病、不良妊娠等。

P.gingivalis生長所需的代謝能來自蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物、血紅素和維生素K。P.gingivalis產(chǎn)生的牙齦素和肽基精氨酸脫亞胺酶(Peptidyl deaminase,PAD)成為其發(fā)病機制中的重要因素。牙齦素會導(dǎo)致局部組織破壞,擾亂宿主的抗菌防御,導(dǎo)致口腔和腸道內(nèi)共生細(xì)菌過度生長及播散。菌群失調(diào)導(dǎo)致有毒代謝物的增加,這促進(jìn)了與心血管疾病和自身免疫相關(guān)的代謝紊亂[2]。

囊泡是細(xì)胞膜的一部分,大小為50～300 nm,形成于A-LPS和具有C-末端結(jié)構(gòu)域(CTD)的蛋白質(zhì)(如牙齦素、PAD或血紅素結(jié)合蛋白35)組成的雙層膜結(jié)構(gòu)[6]。菌毛促使細(xì)菌黏附宿主細(xì)胞、與外基質(zhì)分子、細(xì)胞因子和纖維蛋白原、CD14、β2整合素、TLR(toll樣受體)2、4結(jié)合[2]。這些相互作用使促炎因子合成,如單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等,并誘導(dǎo)多細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、P-選擇素(P-selectin)、E-選擇素(E-selectin)、CD40、CD80和CD86的表達(dá)[7]。其中IL-8能夠啟動可結(jié)合血紅蛋白的受體(HbR),以捕獲卟啉環(huán)和血紅素,從而獲得P.gingivalis生長所需的鐵[2]。它的LPS結(jié)合高度敏感的模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRR)如TLR后[8],通過轉(zhuǎn)錄因子-核因子-κB (NF-κB)依賴性TNF-α的產(chǎn)生,激發(fā)涉及胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases,ERK)的炎癥,激活p38和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)以及上調(diào)纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1的表達(dá)[9],故LPS對細(xì)胞串?dāng)_的作用對P.gingivalis的毒力至關(guān)重要。P.gingivalis與牙周來源致病菌能夠侵入上皮和結(jié)締組織,后進(jìn)入血液導(dǎo)致菌血癥[10]。

2 P.gingivalis與消化系統(tǒng)惡性腫瘤

2.1P.gingivalis與口腔鱗狀細(xì)胞癌口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)TME中多樣化的微生物組成分與癌前組織并不相同,P.gingivalis等牙周病原體與癌變關(guān)系密切,P.gingivalis感染增加OSCC患者的死亡風(fēng)險[11]。它能夠入侵腫瘤細(xì)胞,并在胞質(zhì)中繁殖,周圍的正常細(xì)胞亦可受其影響。研究表明,P.gingivalis作為慢性牙周炎(Periodontitis,PD)和侵襲性牙周炎(Aggressive periodontitis)的優(yōu)勢菌,促進(jìn)OSCC的發(fā)生發(fā)展[12]。目前普遍被學(xué)者接受的4個機制如下:(1)P.gingivalis誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal-transition,EMT):在EMT過程中,上皮細(xì)胞失去本身的特性,獲得間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新特性以及腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲特點[3],此過程存在于多種上皮細(xì)胞來源的腫瘤中。EMT由一組轉(zhuǎn)錄因子控制,包括鋅指蛋白1/2(Zinc finger E-box binding homeobox 1/2,ZEB1/ZEB2)、SNAIL轉(zhuǎn)錄因子、TWIST轉(zhuǎn)錄因子和Slug轉(zhuǎn)錄因子等。P.gingivalis上調(diào)ZEB1/ZEB2水平[13],其中ZEB1與間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)-9和波形蛋白(Vimentin)增加有關(guān)。P.gingivalis還參與磷酸化GSK3-β通路來調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生[5,13]。(2)P.gingivalis抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖:被P.gingivalis感染的上皮呈現(xiàn)出與癌變密切相關(guān)的抗凋亡特性。細(xì)菌LPS與宿主細(xì)胞表面的TLR-4受體結(jié)合,從而激活NF-κB蛋白復(fù)合物。NF-κB調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄,炎性環(huán)境引發(fā)NF-κB失控[9],該復(fù)合物隨后進(jìn)入細(xì)胞核,激活細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄,如IL-6基因。IL-6過度刺激JAK1/STAT3信號通路進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡,同時參與線粒體凋亡、細(xì)胞的分化、遷移和增殖[13]。P.gingivalis可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá),誘導(dǎo)腫瘤血管形成[14]。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(Cytokine signal transduction inhibitors,SOCS)3屬于SOCS家族蛋白,是miRNA-203的靶點[7],它的過表達(dá)通過JAK/STAT3等途徑降低細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和部分G0/G1阻滯[14]。研究提示P.gingivalis感染的人牙齦上皮細(xì)胞(Human gingival epithelial cell,GEC)中miRNA-203水平升高,SOCS3和SOCS6水平降低[14]。核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate kinase,NDk)是一種廣泛存在于真核和原核結(jié)構(gòu)域的酶。它在核苷酸代謝中必不可少,催化磷酸從NTP(核苷三磷酸)轉(zhuǎn)移到NDP(核苷二磷酸)的過程。P.gingivalisNDks不僅可以通過磷酸化Hsp27的絲氨酸殘基誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8,14],而且能抑制嘌呤能受體(P2X7)的ATP活化,減少上皮中IL-1β的產(chǎn)生[8]。IL-1β則是啟動γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)的關(guān)鍵因子,IFN-γ可產(chǎn)生腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞,此過程使腫瘤逃避免疫監(jiān)測[7-8]。(3)P.gingivalis促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移:P.gingivalis感染后MMP-1和MMP-2以及proMMP-9的水平明顯上調(diào),其機制可能是通過ERK1/2-Ets1、p38/HSP27和PAR2/NF-κB通路誘導(dǎo)pro-MMP-9表達(dá),而牙齦素將其轉(zhuǎn)化為MMP-9,導(dǎo)致IL-8依賴性MMP升高,OSCC細(xì)胞株的侵襲力增強[14]。P.gingivalis還可以通過參與巨噬細(xì)胞極化來促進(jìn)OSCC的發(fā)展,P.gingivalis的LPS激活的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基促進(jìn)II-IV期腫瘤的原發(fā)和轉(zhuǎn)移性頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and neck squamous cell cancer,HNSCC)細(xì)胞系的侵襲[15]。P.gingivalis抑制巨噬細(xì)胞吞噬SCC細(xì)胞株(Cal-27),誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞功能極化成M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages,TAMs),上調(diào)TAMs和Cal-27細(xì)胞中腫瘤分子編碼基因的表達(dá),從而引發(fā)OSCC的免疫逃避[16]。(4)P.gingivalis形成有利于TME的炎性環(huán)境:慢性炎癥能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。巨噬細(xì)胞作為非特異性免疫中的主要細(xì)胞,它們隨循環(huán)系統(tǒng)遷移到身體的大部分組織器官中,誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、TNF-α和其他促炎因子的合成和釋放[4]。這些因子抑制細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步擾亂細(xì)胞周期,為OSCC創(chuàng)造有利條件。NF-κB的激活同樣是細(xì)菌引起炎癥的主要因素之一,LPS結(jié)合TLR4后通過NF-κB信號通路誘導(dǎo)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生[11]。此外,P.gingivalis的免疫表達(dá)可能與C-X-C基序趨化因子配體2(CXCL2)和腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(Tumor associated neutrophils,TANs)呈正相關(guān),三者與OSCC患者的不良預(yù)后有關(guān)[11]。P.gingivalis的促炎作用與促腫瘤作用相互交叉。

2.2P.gingivalis與食管鱗狀細(xì)胞癌Gao等[17]對P.gingivalis在食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的重要作用進(jìn)行了研究,結(jié)果提示P.gingivalis可作為監(jiān)測食管癌發(fā)生發(fā)展的重要生物標(biāo)志物。他們從100名患者身上采集的61%的癌組織樣本中檢測到P.gingivalis。P.gingivalis感染是ESCC的一個危險因素。P.gingivalis感染亦與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存時間減少有關(guān)[18]。然而,在食管腫瘤微環(huán)境中,P.gingivalis是否是一種明確的致病因子或癌變組織中的微環(huán)境僅僅有利于它的定植,有待進(jìn)一步深入研究。

P.gingivalis在ESCC發(fā)生發(fā)展中的作用機制與口腔癌有相似之處,亦通過促進(jìn)EMT、干擾宿主細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移來實現(xiàn)。果蠅頭狀因子-3(Grainyhead-like3,GRHL3)是一種轉(zhuǎn)錄因子,參與傷口愈合、血管生成、上皮遷移、表皮分化和屏障形成。研究表明,與未感染的食管癌細(xì)胞相比,P.gingivalis感染的ESCC細(xì)胞系中GRHL3(miR-194的直接靶點)和抑癌基因PTEN(Phosphatase and tensin)的水平降低,p-Akt及miR-194水平上調(diào),而miR-194的抑制或過度表達(dá)對食管癌細(xì)胞株(KYSE-30和KYSE-150)的遷移和侵襲有顯著影響[18]。綜上,P.gingivalis通過miR194/GRHL3/PTEN/Akt信號軸促進(jìn)ESCC增殖和遷移。研究發(fā)現(xiàn)P.gingivalis在食道TME中通過觸發(fā)NF-κB信號通路,促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[19]。Beclin1是自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,由Becn1基因編碼, Beclin1在腫瘤發(fā)生中起著重要作用,P.gingivalis感染和Beclin1下調(diào)增強ESCC細(xì)胞(KYSE150和KYSE30)的增殖、遷移和抗凋亡能力[20]。研究表明P.gingivalis的細(xì)胞內(nèi)侵襲通過轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)依賴性轉(zhuǎn)錄因子(Smads)/Yes相關(guān)蛋白(YAP)/具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄輔激活子(TAZ)增強ESCC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[21]。Smads/YAP/TAZ/TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子1(TEAD1)復(fù)合物的形成對于啟動下游靶基因、誘導(dǎo)EMT至關(guān)重要。此外,P.gingivalis還能通過跨膜蛋白GARP上調(diào)增加TGF-β的分泌和生物活性。

2.3P.gingivalis與胰腺癌胰腺癌(Pancreatic cancer)的預(yù)后極差,5年生存率僅為10%左右[22],其中胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是最常見的胰腺惡性腫瘤類型,其轉(zhuǎn)移風(fēng)險高,約占所有胰腺癌病例的90%[23]。口腔中的P.gingivalis感染及牙周病增加了胰腺癌發(fā)生的風(fēng)險。P.gingivalis引起的TLR激活可以刺激胰腺,并顯著加速小鼠胰腺癌的發(fā)生[24]。一項體外動物實驗結(jié)果提示P.gingivalis促進(jìn)胰腺導(dǎo)管細(xì)胞中TGF-β信號通路的激活[25]。有證據(jù)表明,TGF-β及其下游信號分子在胰腺癌發(fā)生中起關(guān)鍵作用[26]。TGF-α信號通路可能參與益生菌對PDAC進(jìn)展的抑制作用?？谇恢薪臃NP.gingivalis可加速胰腺上皮內(nèi)瘤變(PanIN)的發(fā)展,益生菌可能通過降低癌細(xì)胞增殖,抑制PanIN進(jìn)展和EMT的發(fā)生[25]。在胰腺TME中,P.gingivalis可招募TANs,并增加CXC和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)的釋放,產(chǎn)生促炎性微環(huán)境,有助于胰腺腫瘤的進(jìn)展[27]。P.gingivalis等相關(guān)菌群感染通過miR-21水平升高和PTEN水平降低來促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和化療耐藥[28]?？梢?P.gingivalis在某種程度上被認(rèn)為是胰腺癌發(fā)生和發(fā)展的一個生物標(biāo)志物。

2.4P.gingivalis與其他消化道腫瘤尚無證據(jù)表明肝癌與P.gingivalis的直接關(guān)系,但相關(guān)研究表明P.gingivalis參與非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)及肝纖維化等疾病的發(fā)生發(fā)展[29-30]。使用高脂肪飲食(HFD)誘導(dǎo)的NASH小鼠模型,P.gingivalis感染后加重了肝臟炎癥和纖維化。P.gingivalis和LPS刺激可誘導(dǎo)造血干細(xì)胞和肝細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1和半乳糖凝集素-3(Gal-3),它們在肝纖維化的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。P.gingivalis的亮氨酸-異亮氨酸-纈氨酸(Leucine-isoleucine-valine,LIV)系統(tǒng)可能通過誘導(dǎo)支鏈氨基酸水平的增加而加重NAFLD和NASH。P.gingivalis和放線菌也有助于肝硬化患者胰腺癌的發(fā)生[31]。

口腔病原體與胃癌(Gastric cancer,GC)前病變之間尚無明確聯(lián)系。有研究顯示在高P.gingivalis檢出的個體中,牙周病原體與胃癌前病變的風(fēng)險相關(guān)性增加,口腔內(nèi)的有菌環(huán)境以及牙周病原體可能與胃癌前病變發(fā)生有關(guān)聯(lián)[32]。目前僅有研究表明PD病原菌中的具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum)和胃癌有關(guān)聯(lián)[33],尚無證據(jù)表明單獨P.gingivalis與GC的發(fā)展有關(guān)。消化道腫瘤患者的口腔微生物群顯示出更高的細(xì)菌多樣性,如P.gingivalis、齦下福賽斯坦納菌(Tannerella forsythia,T.forsythia)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola,T.denticola)和伴放線聚集桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Aa)[34]。

結(jié)腸黏膜屬于厭氧環(huán)境,pH值高,有利于P.gingivalis黏附,繼而通過促進(jìn)微環(huán)境中炎癥因子的釋放,最終促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生。此外,結(jié)腸菌群受口腔細(xì)菌的影響,特別是長期持續(xù)感染P.gingivalis引起腸道菌群失調(diào)。除P.gingivalis外,其他牙周病原體包括放線菌,也可以播散至結(jié)腸,口腔與結(jié)腸的這種連接關(guān)系是口腔細(xì)菌介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)的另一種途徑[10]。Lin等[35]通過實驗證明P.gingivalis的GroEL蛋白能夠通過增強內(nèi)皮細(xì)胞的功能以及血管生成加速腫瘤生長,并降低小鼠模型的生存率。還有一項研究[36]顯示C57BL/6N小鼠持續(xù)5周感染P.gingivalis,可導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥,降低回腸緊密連接蛋白(Zonula Occludens-1,ZO-1)基因的表達(dá)水平。P.gingivalis在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制仍需深入研究。

3 啟發(fā)

P.gingivalis是牙周炎的主要病原體,可直接或間接地引起全身其他臟器的各種損害。在腫瘤方面,首先,口腔牙菌斑中篩查P.gingivalis可以初步篩查易感人群,有助于癌癥的預(yù)防和早期診斷;其次,改善口腔衛(wèi)生在一定程度上可降低癌癥發(fā)病的風(fēng)險。聯(lián)合使用抗P.gingivalis療法和手術(shù)、放療或化療,新輔助治療是阻斷P.gingivalis促進(jìn)消化系統(tǒng)腫瘤的方法。深入研究P.gingivalis在惡性腫瘤中的作用,有助于指導(dǎo)個體化治療,提高患者的生活質(zhì)量。

WHO在2007年提出應(yīng)鼓勵促進(jìn)口腔健康,將其作為健康生活方式的不可或缺的一部分。減少P.gingivalis的負(fù)荷被認(rèn)為是可變因素,牙周治療對預(yù)防OSCC有直接或間接的積極影響,在抗菌藥物的使用方面仍需要進(jìn)一步探索。對于食管癌,目前常用的血清標(biāo)記對ESCC的早期檢測和進(jìn)展沒有足夠的敏感性和特異性。ESCC患者唾液中唾液鏈球菌和P.gingivalis的表達(dá)顯著增加,這些細(xì)菌結(jié)合考慮到年齡、性別、吸煙、酒精攝入和過熱飲食偏好時,對ESCC有較高的預(yù)測價值[37]。進(jìn)一步研究P.gingivalis對胰腺癌的作用機制,有助于降低胰腺癌的死亡率。對P.gingivalis的致病機理進(jìn)行阻斷有望預(yù)防疾病、減弱其影響和改善預(yù)后。

(利益沖突 所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明 買熱拍提·買明:起草文章;熱孜萬姑麗·亞森:文獻(xiàn)檢索,收集及整理;李晨曦:分析并解釋相關(guān)內(nèi)容,文章修回、審閱;龔忠誠:研究設(shè)計,監(jiān)督指導(dǎo),文章審閱,獲取研究經(jīng)費。)