徐婭冬, 李雅麗, 黃魏寧

(1北京市東城區(qū)第一人民醫(yī)院耳鼻喉科, 北京 100075; 2衛(wèi)生部北京醫(yī)院耳鼻喉科, 北京 100005)

噪聲性聽(tīng)力損失(Noise-induced hearing loss,NIHL)是勞動(dòng)者長(zhǎng)期暴露于噪聲環(huán)境引起的一種感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失性疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界范圍內(nèi)約1/10的人口由于長(zhǎng)期暴露于噪聲作業(yè)環(huán)境存在NIHL風(fēng)險(xiǎn)[1]。研究顯示,當(dāng)暴露于相同的噪聲作業(yè)環(huán)境時(shí),僅部分個(gè)體發(fā)生NIHL,且聽(tīng)力損失的程度也表現(xiàn)出個(gè)體差異[2]。有學(xué)者指出,對(duì)相同環(huán)境條件下表現(xiàn)聽(tīng)力損失差異的原因可能與易感性基因突變有關(guān)[3]。組蛋白修飾是調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制之一,組蛋白去乙?；?HDACs)是催化完成組蛋白修飾的重要酶,HDACs參與調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移等多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。組蛋白去乙?；?(HDAC2)是HDACs成員之一,在哺乳動(dòng)物多種細(xì)胞中均有表達(dá),尤其在耳蝸組織中廣泛表達(dá)[4]。研究發(fā)現(xiàn)[5],突發(fā)性感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失(Sudden sensorineural hearing loss,SSNHL)患者HDAC2呈現(xiàn)低表達(dá),與患者治療時(shí)糖皮質(zhì)激素抵抗有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)[6],茶堿能夠通過(guò)維持HDAC2表達(dá)減輕慶大霉素誘導(dǎo)的耳蝸毛細(xì)胞毒性,提示HDAC2與感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失有關(guān)。HDAC2基因存在多個(gè)基因多態(tài)性(SNP)位點(diǎn),萬(wàn)瑾凌[7]發(fā)現(xiàn)HDAC2基因的rs2810164和rs538681位點(diǎn)基因突變與精神分裂癥易感性有關(guān);王冉等[8]研究顯示HDAC2基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)與男性酒精使用認(rèn)知功能有關(guān)。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法探究HDAC2基因SNP位點(diǎn)與從事噪音作業(yè)工人發(fā)生NIHL風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年6月-2022年6月北京市東城區(qū)第一人民醫(yī)院耳鼻喉科確診的246例NIHL患者為觀察組,按照1∶1匹配選取同時(shí)期246例聽(tīng)力未損傷者為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)NIHL符合2014版《職業(yè)性噪聲聾的診斷》[9]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),即雙耳高頻聽(tīng)閾>25 dB;(2)從事噪聲作業(yè)者,工齡3年以上;(3)個(gè)體之間無(wú)血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)中耳炎、耳膜穿孔等其他耳病病史;(2)顱腦損傷、腮腺炎、耳毒藥物服用史、家族性耳聾等其他可能引起耳聾的病因者;(3)作業(yè)場(chǎng)所存在爆震、高溫、重金屬等理化因素致聾者;(4)從事噪聲作業(yè)前已存在聽(tīng)力損失者。本研究通過(guò)北京市東城區(qū)第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批號(hào):19093),所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 資料的收集 采用問(wèn)卷調(diào)查法收集所有研究對(duì)象的基本資料,包括:性別、年齡、吸煙史、飲酒史、近期有無(wú)耳毒藥物服用史、家族耳聾病史及其他疾病史;噪聲暴露情況,包括噪聲暴露時(shí)間、工作中有無(wú)接觸理化有害物質(zhì)。共發(fā)放與回收有效問(wèn)卷均492份。

1.2.2 純音聽(tīng)力檢測(cè)[10]測(cè)試均由同一位專業(yè)人員測(cè)量,所有研究對(duì)象測(cè)試前脫離噪聲作業(yè)≥48 h,采用AD226聽(tīng)力計(jì)(丹麥Interacoustics)測(cè)試隔音室本底噪聲<25 dB,測(cè)量雙耳6個(gè)頻率純音氣導(dǎo)聽(tīng)閾值(0.5、1、2、3、4、6 KHz),測(cè)試結(jié)果依據(jù)GB/T 7582-2004進(jìn)行調(diào)整。

1.2.3 作業(yè)噪聲測(cè)量[11]根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)GBZ/T 189.8-2007要求,采用Noise pro多功能噪聲劑量計(jì)(美國(guó)QUEST)測(cè)量,將傳感器放置于工人耳部高度,對(duì)向聲源方向測(cè)量,取多個(gè)采樣點(diǎn)測(cè)量8 h等效連續(xù)A聲級(jí),計(jì)算累積噪聲暴露量以評(píng)價(jià)實(shí)際的噪聲暴露強(qiáng)度。

1.2.4 HDAC2基因多態(tài)性檢測(cè) 樣本采集及DNA提取:采集所有受試者空腹靜脈血2 mL,置于抗凝管中混勻,3 000 r/min離心12 min獲取上清液,PE管分裝,采用全血基因組DNA快速提取試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)提取基因組DNA?；蚍中?采用PCR-RFLP檢測(cè)外周血HDAC2 SNP位點(diǎn),按照PCR擴(kuò)增試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher公司)說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行目的基因擴(kuò)增,獲得PCR產(chǎn)物,引物序列見(jiàn)表1?；厥誔CR產(chǎn)物,進(jìn)行RELP檢測(cè),設(shè)定反應(yīng)體系:PCR產(chǎn)物4.0 μL,緩沖液1.0 μL,限制性內(nèi)切酶(北京藍(lán)博斯特生物技術(shù)有限公司)1.0 μL,ddH2O 9 μL,37℃水浴2 h酶切,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物基因型。

表1 HDAC2基因SNP位點(diǎn)PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對(duì)照組基線資料及噪聲暴露情況比較觀察組與對(duì)照組在年齡、性別分布、吸煙史、飲酒史、噪聲暴露時(shí)間、噪聲暴露強(qiáng)度方面比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與對(duì)照組比較,觀察組高頻聽(tīng)閾升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 觀察組與對(duì)照組基線資料比較

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)多態(tài)性測(cè)序結(jié)果顯示,HDAC2基因的SNP位點(diǎn)(rs10499080、rs12208304、rs6568819、rs1320445和rs3757016)均存在3種基因型(野生型、雜合型及純合型);經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),5個(gè)SNP位點(diǎn)均具有群體代表性(P>0.05),見(jiàn)表3。

表3 PAPP-A、PPAR-γ基因多態(tài)性Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2.3 觀察組與對(duì)照組HDAC2基因多態(tài)性比較觀察組與對(duì)照組HDAC2基因rs12208304、rs1320445和rs3757016位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);觀察組與對(duì)照組HDAC2基因rs10499080和rs6568819位點(diǎn)基因型分布比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與對(duì)照組比較,觀察組rs10499080和rs6568819位點(diǎn)T等位基因頻率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 觀察組與對(duì)照組HDAC2基因多態(tài)性比較/例(%)

2.4 HDAC2基因多態(tài)性與NIHL易感性Logistic回歸分析Logistic回歸分析表明,以HDAC2基因SNP位點(diǎn)野生型基因?yàn)閰⒄?rs12208304、rs1320445和rs3757016位點(diǎn)各基因型患者發(fā)生NIHL的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯增加(P>0.05);rs10499080位點(diǎn)TT基因型[OR(95%CI)=1.659(1.120～2.694)]及隱性模型CT+TT基因型[OR(95%CI)=1.944(1.120～3.217)]NIHL風(fēng)險(xiǎn)增加(P<0.05);顯性模型CC+CT基因型[OR(95%CI)=0.731(0.535～0.917)]NIHL風(fēng)險(xiǎn)降低(P<0.05);rs6568819位點(diǎn)患者TT基因型[OR(95%CI)=3.108(1.531～8.731)]及隱性模型CT+TT基因型[OR(95%CI)=1.510(1.031～2.536)]NIHL風(fēng)險(xiǎn)增加(P<0.05);顯性模型CC+CT基因型[OR(95%CI)=0.892(0.420～0.954)]NIHL風(fēng)險(xiǎn)降低(P<0.05),見(jiàn)表5、圖1。

圖1 HDAC2基因rs10499080和rs6568819位點(diǎn)Logistic回歸分析森林圖

表5 HDAC2基因多態(tài)性與NIHL易感性Logistic回歸分析

3 討論

職業(yè)損害調(diào)查顯示,噪聲暴露不良作業(yè)環(huán)境時(shí)導(dǎo)致聽(tīng)力損傷的主要環(huán)境因素,合并基礎(chǔ)疾病者也易發(fā)生聽(tīng)力損傷[12-13]。NIHL發(fā)生機(jī)制不僅與噪聲暴露的環(huán)境有關(guān),還與易感性基因突變有關(guān),在相同噪聲暴露條件下,聽(tīng)閾偏倚的最大與最小值相差可達(dá)70 dB,說(shuō)明個(gè)體之間存在聽(tīng)力損失易感性的差異[14]。個(gè)體之間存在多個(gè)NIHL易感性基因,如粒狀頭樣2(GRHL2)[15]、胱天蛋白酶激活與募集結(jié)構(gòu)域8(CARD8)[16]等。關(guān)于NIHL遺傳多樣性的報(bào)道也逐漸增多,多態(tài)性基因涉及氧化應(yīng)激、毛細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制,如超氧化物歧化酶rs2855116位點(diǎn)、GRHL2基因rs1981361位點(diǎn)等,為探尋NIHL發(fā)病原因提供了豐富思路[17]。

研究顯示,噪聲暴露能夠誘導(dǎo)工人及動(dòng)物模型發(fā)生聽(tīng)力損傷相關(guān)基因表達(dá)變化,提示噪聲與表觀遺傳效應(yīng)存在一定關(guān)聯(lián)[18]。組蛋白修飾是表觀遺傳改變的重要途徑,HDAC2作為HDACs家族重要成員,參與組蛋白去乙?；^(guò)程,該過(guò)程與聽(tīng)力損失關(guān)系密切。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn),HDAC2基因存在多個(gè)SNP位點(diǎn),且證實(shí)SNP位點(diǎn)與強(qiáng)迫癥、糖尿病等多種疾病的發(fā)生有關(guān)[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn),觀察組與對(duì)照組HDAC2基因rs12208304、rs1320445和rs3757016位點(diǎn)基因多態(tài)性無(wú)差異,且經(jīng)Logistic回歸分析證實(shí)上述3個(gè)位點(diǎn)與NIHL易感性無(wú)關(guān),說(shuō)明上述3個(gè)位點(diǎn)堿基突變并未引起該基因功能改變,可能與細(xì)胞自我修復(fù)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[21],SSNHL患者HDAC2 mRNA及蛋白表達(dá)水平較健康者降低,且糖皮質(zhì)激素敏感SSNHL患者治療后HDAC2表達(dá)水平較耐藥患者顯著提高。周瓊瓊等[22]從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面證實(shí),脂多糖誘導(dǎo)的急性聽(tīng)力損失豚鼠模型發(fā)生糖皮質(zhì)激素抵抗與HDAC2有關(guān),分析機(jī)制為,HDAC2能夠被募集至炎癥基因啟動(dòng)子區(qū)促使其去乙酰化,從而抑制促炎基因表達(dá),說(shuō)明HDAC2與聽(tīng)力損失關(guān)系密切。

本研究發(fā)現(xiàn),HDAC2基因rs10499080和rs6568819位點(diǎn)均發(fā)生堿基C→T突變,NIHL患者T等位基因頻率高于對(duì)照組,說(shuō)明HDAC2基因的2個(gè)SNP位點(diǎn)(rs10499080和rs6568819)可能與NIHL有關(guān)。經(jīng)Logistic分析發(fā)現(xiàn),rs10499080和rs6568819位點(diǎn)的TT基因型及隱性模型CT+TT基因型NIHL風(fēng)險(xiǎn)增加,兩位點(diǎn)的顯性模型CC+CT基因型NIHL風(fēng)險(xiǎn)降低,提示攜帶隱性模型基因或T等位基因者NIHL風(fēng)險(xiǎn)較高,進(jìn)一步證實(shí)HDAC2基因的兩個(gè)SNP位點(diǎn)與NIHL存在密切關(guān)聯(lián)。Wang等[23]通過(guò)構(gòu)建NIHL小鼠模型發(fā)現(xiàn)小鼠聽(tīng)力閾值與耳蝸毛細(xì)胞數(shù)量有關(guān),分析發(fā)現(xiàn)染色盒同源物4(CBX4)基因突變能誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞凋亡,從而影響小鼠聽(tīng)力。另有體外研究發(fā)現(xiàn)[24],噪聲暴露可導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞ATP耗竭,ATP耗竭能夠?qū)е陆M蛋白去乙?；?最終導(dǎo)致毛細(xì)胞丟失。由此可分析HDAC2基因突變導(dǎo)致NIHL風(fēng)險(xiǎn)增加的原因?yàn)?一方面HDAC2基因突變可通過(guò)影響HDAC2表達(dá)而影響組蛋白去乙?；?引起耳蝸毛細(xì)胞凋亡,從而導(dǎo)致聽(tīng)力損失[25];另一方面HDAC2基因突變能對(duì)炎癥、氧化應(yīng)激等與聽(tīng)力損失相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)的去乙?；^(guò)程產(chǎn)生影響,從而抑制相關(guān)基因表達(dá),最終導(dǎo)致聽(tīng)力損失風(fēng)險(xiǎn)增加[26]。

綜上所述,HDAC2基因rs10499080和rs6568819位點(diǎn)堿基C突變?yōu)門的噪聲作業(yè)工人發(fā)生NIHL的風(fēng)險(xiǎn)較高,為臨床中預(yù)測(cè)職業(yè)環(huán)境聽(tīng)力損失風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。本課題組在后續(xù)研究中會(huì)對(duì)HDACs家族其他基因之間及基因與環(huán)境之間是否存在交互作用進(jìn)行深入研究,為保證職業(yè)健康提供更科學(xué)的依據(jù)。