王奇林,董昌武,徐 慧,劉 陽(yáng),李 茜,宋 敏

(安徽中醫(yī)藥大學(xué),安徽 合肥 230012)

自發(fā)性高血壓是一種由多種因素引起的血壓升高的全身性疾病,是心腦血管疾病最主要的誘發(fā)因素,可對(duì)多個(gè)重要臟器造成損害,如心、腦、腎,并可最終導(dǎo)致這些臟器衰竭[1-2]。高血壓病引起的心肌病變是導(dǎo)致心臟受損的主要因素,中國(guó)每年約有200萬(wàn)患有高血壓病的個(gè)體發(fā)生心功能損傷[3],其中自發(fā)性高血壓約占40%。目前,自發(fā)性高血壓的治療方式主要使用一線降壓藥控制血壓,如臨床常用鈣離子拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等,用藥時(shí)間幾乎貫穿整個(gè)發(fā)病過(guò)程,長(zhǎng)時(shí)間的高血壓狀態(tài)所產(chǎn)生的并發(fā)癥對(duì)機(jī)體造成的傷害遠(yuǎn)大于高血壓本身。

中藥治療自發(fā)性高血壓有降壓后不易反彈的優(yōu)勢(shì)。因此,尋找行之有效的中藥治法或中西藥結(jié)合治法將有助于降低高血壓及其并發(fā)癥對(duì)人體的損害。自發(fā)性高血壓損傷心臟的主要方式是心室重構(gòu),心室重構(gòu)最主要的病理變化是心肌纖維化[4],故預(yù)防心肌纖維化是防治自發(fā)性高血壓并發(fā)癥的一個(gè)重要方向。研究[5-7]顯示,心肌纖維細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)分化在心肌纖維化中具有重要作用,在轉(zhuǎn)分化的心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)可進(jìn)一步激活結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ,Col-Ⅰ)[7]、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)等心肌纖維化的相關(guān)因子,從而導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。

滋陰潛陽(yáng)方[8]是臨床治療自發(fā)性高血壓的有效方,其主要由龜板、石決明、煅牡蠣、制何首烏、鉤藤、熟地黃、生地黃、川芎等組成。前期研究[9]發(fā)現(xiàn),滋陰潛陽(yáng)方具有改善“兩腎一夾”高血壓大鼠左心室重構(gòu)的作用,但其對(duì)心肌纖維化的影響機(jī)制尚未明確。本研究建立自發(fā)性高血壓大鼠模型,觀察滋陰潛陽(yáng)方對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠左心室重構(gòu)的改善作用并探究其抑制心肌纖維化的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性自發(fā)性高血壓大鼠40只,12周齡,體質(zhì)量為(230±20)g,SPF級(jí)Wistar雄性大鼠10只,體質(zhì)量為(230±20)g。所有動(dòng)物均購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011。所有大鼠均飼養(yǎng)于安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,室溫為(23±3)℃,濕度控制為(45±5)%,12 h光暗循環(huán)。本研究由安徽中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),證明號(hào):2022021。

1.2 藥物 滋陰潛陽(yáng)方藥物組成:龜板、石決明(先煎)、煅牡蠣(先煎)各30 g,制何首烏、鉤藤(后下)各20 g,熟地黃、生地黃、川芎各15 g,以上藥物均購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。煎煮方法:連續(xù)2次煎藥,取2次過(guò)濾液,再置于低溫恒溫水浴中濃縮至含生藥質(zhì)量濃度為2 g/mL,藥液裝瓶,4 ℃存儲(chǔ)。依那普利(江蘇制藥股份有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H32026567,每片10 mg),購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院西藥房。

1.3 儀器 大鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)(NS60):上海玉研科學(xué)儀器有限公司;電泳儀(型號(hào) EPS300)、電泳槽(型號(hào) VE-180)、轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào) VE-186):上海天能科技有限公司;高速冷凍離心機(jī)(型號(hào) JW-3021HR):安徽嘉文儀器裝備有限公司;熒光定量PCR儀(型號(hào) PIKOREAL 96):Thermo Scientific。

1.4 試劑 α-SMA抗體(批號(hào) AF10212367P)、Col-Ⅰ抗體(批號(hào) AI04234760)、CTGF抗體(批號(hào) AD19286640):Bioss;GAPDH(批號(hào)210040421):Zsbio;PVDF膜(批號(hào)R7SA9081E):Millipore;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)AL50947A):TaKaRa。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》[10],以大鼠收縮壓高于115 mmHg判定為高血壓模型復(fù)制成功;以性情易激惹、飲水量增加判定大鼠證型為陰虛陽(yáng)亢;綜合以上標(biāo)準(zhǔn),判斷自發(fā)性高血壓大鼠是否符合陰虛陽(yáng)亢型高血壓模型。

將40只符合模型標(biāo)準(zhǔn)的自發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分為模型組,滋陰潛陽(yáng)方高、低劑量組,依那普利組,每組10只,另取10只Wistar大鼠作為正常組。模型組和正常組大鼠每日給予0.9% NaCl溶液10 mL/kg灌胃。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》[10]中常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的體表面積比例換算方法,依那普利組給予依那普利1.05 mg/(kg·d),滋陰潛陽(yáng)方低、高劑量組分別給予大鼠5.85、23.4 g/(kg·d)(分別相當(dāng)于成人臨床用藥的等效劑量1、4倍劑量)滋陰潛陽(yáng)方湯劑灌胃,每日2次,連續(xù)給藥6周。

2.2 血壓測(cè)量 用無(wú)創(chuàng)血壓采集系統(tǒng)分別測(cè)量各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓4次,依次為給藥前,給藥2、4、6周后。每次每只大鼠測(cè)量3次,取平均值。

2.3 取材 藥物干預(yù)6周后,用20%烏拉坦對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。迅速處死大鼠,開(kāi)胸,取出心臟。一部分心肌組織用預(yù)冷的生理鹽水沖洗殘留血液后固定于4%多聚甲醛溶液中,24 h后進(jìn)行組織脫水、包埋及切片處理。另一部分心肌組織用PBS洗滌血液后,用組織剪剪成小拇指指甲蓋大小的小塊,液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。

2.4 Masson染色觀察大鼠心肌纖維化情況 心肌組織切片后脫蠟至水,進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。顯微鏡下觀察各組切片染色情況,膠原纖維呈藍(lán)色,肌纖維呈紅色,隨機(jī)選取5個(gè)視野留取圖像進(jìn)行分析。

2.5 Western blot法檢測(cè)大鼠心肌組織CTGF、Col-Ⅰ及α-SMA蛋白表達(dá)水平 每組各取3只大鼠左心室組織樣本100 mg,加入RIPA細(xì)胞裂解液600 μL(內(nèi)含0.6 mmol PMSF)進(jìn)行裂解。12 000 r/min離心15 min,收集上清液,即為總蛋白液。在SDS-PAGE膠中電泳,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印到PVDF膜,轉(zhuǎn)印結(jié)束后將PVDF膜放入 Western封閉液(5%脫脂奶粉)中封閉2 h。按照合適的比例用一抗稀釋液進(jìn)行稀釋,4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜。加入PBST,每次洗滌10 min,共洗滌3次。洗膜結(jié)束后用二抗室溫孵育1.2 h,洗滌液將條帶放入ECL顯影液,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶,以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.6 RT-PCR法檢測(cè)大鼠心肌組織CTGF、Col-Ⅰ及α-SMA mRNA表達(dá)水平 每組各取3只大鼠左心室組織100 mg,加入1 mL TRIzol裂解。待裂解完全后室溫放置5 min。12 000 r/min離心10 min,取上清液,加入適量無(wú)水乙醇?；靹蚝蠹尤氲絉NA提取柱中,依次加入反應(yīng)液,提取總RNA溶液,測(cè)定總RNA濃度及純度后逆轉(zhuǎn)錄,即為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),以正常組為參照組,β-actin為內(nèi)參,以2-ΔΔCT法計(jì)算各組大鼠心肌組織CTGF、Col-Ⅰ及α-SMA mRNA的表達(dá)量。引物合成序列見(jiàn)表1。

表1 β-actin、α-SMA、Col-Ⅰ、CTGF引物合成序列

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠收縮壓比較 與正常組比較,各時(shí)點(diǎn)各組大鼠尾部收縮壓顯著升高(P<0.05),表明模型復(fù)制成功;模型組大鼠收縮壓隨時(shí)間而逐漸升高。與模型組比較,給藥2周后依那普利組與滋陰潛陽(yáng)方高劑量組大鼠收縮壓均顯著降低(P<0.05),其中滋陰潛陽(yáng)方高劑量組收縮壓降低更明顯(P<0.05);與模型組比較,給藥4、6周后依那普利組,滋陰潛陽(yáng)方高、低劑量組大鼠收縮壓均顯著降低(P<0.05),其中以滋陰潛陽(yáng)方高劑量組降低作用最明顯,依那普利組次之(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠收縮壓比較

3.2 各組大鼠心肌組織纖維化情況比較 模型組大鼠心肌組織可見(jiàn)大量藍(lán)色心肌膠原纖維增生,心肌纖維化明顯;與模型組相比,滋陰潛陽(yáng)方高劑量組與依那普利組大鼠心肌組織藍(lán)色心肌膠原纖維明顯減少,而滋陰潛陽(yáng)方低劑量組大鼠心肌組織仍可見(jiàn)大量藍(lán)色心肌膠原纖維增生。見(jiàn)圖1。

注:A.正常組;B.模型組;C.滋陰潛陽(yáng)方高劑量組;D.滋陰潛陽(yáng)方低劑量組;E.依那普利組圖1 各組大鼠心肌組織纖維化情況比較(Masson染色,10×20倍)

3.3 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)水平比較 與正常組比較,模型組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05);與模型組比較,滋陰潛陽(yáng)方高劑量組和依那普利組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3、表4、圖2。

注:A.正常組;B.模型組;C.滋陰潛陽(yáng)方高劑量組;D.滋陰潛陽(yáng)方低劑量組;E.依那普利組圖2 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白表達(dá)電泳圖

表3 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白表達(dá)水平比較

表4 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA mRNA表達(dá)水平比較

4 討論

研究[12-14]表明,中醫(yī)藥在治療高血壓病及其并發(fā)癥方面確有良好療效。自發(fā)性高血壓屬中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”等范疇,由多種內(nèi)外因素相互影響而成,中醫(yī)認(rèn)為,本病的病機(jī)以陰虛為主,尤以心、肝、腎三臟陰虛所致。肝腎陰虛致陽(yáng)亢難制,腎水不足亦導(dǎo)致心陰不足、心腎不交,長(zhǎng)期心陰不足造成心氣虧虛甚或心陽(yáng)不振,導(dǎo)致水濕甚或瘀血的產(chǎn)生,水濕、瘀血內(nèi)阻則導(dǎo)致疾病發(fā)展及加重。本病病位在心,常累及肝、腎、脾、肺等臟器,臨床治療多采用滋陰、潛陽(yáng)、祛濕、活血等方法。高爾鑫教授根據(jù)本病的病因病機(jī),創(chuàng)制具有滋陰潛陽(yáng)作用的中藥復(fù)方滋陰潛陽(yáng)方,該方是在鎮(zhèn)肝息風(fēng)湯和天麻鉤藤飲的基礎(chǔ)上化裁而來(lái),臨床用于治療自發(fā)性高血壓療效良好[15-16]。滋陰潛陽(yáng)方通過(guò)益陰補(bǔ)血、祛瘀通絡(luò)改善自發(fā)性高血壓造成的心臟損傷。方中重用龜板、生地黃、熟地黃滋養(yǎng)肝腎之陰,加入鉤藤降壓作用良好;石決明、牡蠣兩藥重鎮(zhèn)潛陽(yáng),川芎活血祛瘀通絡(luò),針對(duì)本病本虛標(biāo)實(shí)之病機(jī)。諸藥共奏滋陰潛陽(yáng)之功,從而有效治療陰虛陽(yáng)亢型高血壓。自發(fā)性高血壓所致心肌纖維化的臨床癥狀可表現(xiàn)為心胸憋悶、疼痛,并伴有頭暈或頭痛。憋悶、疼痛多為血行不暢所致,陰血同源,長(zhǎng)期心腎不交導(dǎo)致心血不足,滋陰潛陽(yáng)方中用牡蠣、龜板兩藥補(bǔ)心血之虧兼養(yǎng)心神,再加生地黃、熟地黃兩藥以滋腎陰,共奏滋養(yǎng)心腎之功;頭暈、頭痛多為陽(yáng)亢難制所致,方中鉤藤制風(fēng)、川芎活血祛瘀通絡(luò)。諸藥共用,標(biāo)本兼治,故藥味雖少,療效頗佳。滋陰潛陽(yáng)方可有效改善自發(fā)性高血壓所致心肌纖維化。

心肌纖維化主要表現(xiàn)為膠原沉積、比例失調(diào)并伴有心肌成纖維細(xì)胞的增生[17]。血管緊張素Ⅱ、醛固酮等促成高血壓的因子可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,導(dǎo)致膠原蛋白被大量合成,從而導(dǎo)致和加重心肌纖維化[18]。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞活化的標(biāo)志性蛋白,肌成纖維細(xì)胞可大量合成Col-Ⅰ,導(dǎo)致膠原代謝異常[19]。CTGF作為促成纖維細(xì)胞分裂和膠原沉積的細(xì)胞因子,可介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的部分生物效應(yīng),從而刺激心肌成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外膠原的沉積,在促進(jìn)纖維化方面發(fā)揮重要作用[20]。

本研究結(jié)果顯示,滋陰潛陽(yáng)方具有降低自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓的功效,隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng),大鼠的收縮壓呈持續(xù)降低狀況,與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[8]。滋陰潛陽(yáng)方高劑量組和依那普利組可明顯降低自發(fā)性高血壓大鼠的收縮壓(P<0.05),而低劑量組降壓作用不明顯。滋陰潛陽(yáng)方高劑量組和依那普利組可明顯降低自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織中Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)水平(P<0.05),而低劑量組作用不明顯。

綜上,滋陰潛陽(yáng)方可能通過(guò)抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)分化等過(guò)程,抑制自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的發(fā)展,其作用途徑有待進(jìn)一步研究。