◎ 張逍遙，楊筱舟，向 甜，張小鶯

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院 秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），陜西 漢中 723000）

由于中波紫外線（Ultraviolet B，UVB）的波長(zhǎng)較短極易被皮膚吸收，因此是造成皮膚光老化的主要輻射類型[1]。山茱萸（Cornus officinalisSieb. et Zucc.）的成熟果肉富含酚類和環(huán)烯醚萜等多種活性成分[2]。本研究用UVB 照射HaCaT 細(xì)胞構(gòu)建光老化模型，通過(guò)檢測(cè)山茱萸水提物（Cornus officinalisWater Extract，COW）對(duì)經(jīng)UVB 照射HaCaT 細(xì)胞的抗氧化酶活力的影響，在細(xì)胞層面驗(yàn)證COW 抗光老化的能力。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

HaCaT 細(xì)胞、DMEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶，購(gòu)自武漢尚恩生物科技公司；山茱萸果，購(gòu)自陜西金慧方中藥科技公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、BCA 蛋白濃度和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒，均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；葡萄糖、蘆丁和沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自上海源葉生物科技公司。

UVB 紫外燈，購(gòu)自南京華強(qiáng)電子公司；紫外輻照檢測(cè)計(jì)和UVB-X0 探頭，購(gòu)自深圳市林上科技公司。

1.2 方法

1.2.1 提取山茱萸水提物

取100 g果肉加入500 mL水中，60 ℃超聲提取1 h，后20 000×g 離心20 min，收集上清，沉淀，重復(fù)上述步驟，二次離心后再重復(fù)上述步驟，合并3 次上清進(jìn)行熱回流提取，經(jīng)冷凍干燥獲得COW[3]。

1.2.2 COW 中總多糖、總多酚和總黃酮含量測(cè)定

（1）采用苯酚-硫酸法測(cè)總多糖含量[4]。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照建標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制不同濃度梯度葡萄糖溶液為待測(cè)液（0 mg·mL-1、30 mg·mL-1、60 mg·mL-1、90 mg·mL-1和120 mg·mL-1），然后取1 mL 待測(cè)液、1 mL 6%苯酚和5 mL 濃H2SO4于25 ℃避光20 min 后30 ℃水浴25 min，測(cè)定490 nm 處吸光值；后用同樣方法測(cè)1 mg·mL-1COW 的吸光值。

（2）采用Folin-酚比色法測(cè)總多酚含量[4]。以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照建標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制不同濃度梯度的沒(méi)食子酸溶液為待測(cè)液（0 mg·mL-1、55.5 mg·mL-1、111.0 mg·mL-1、222.0 mg·mL-1和277.5 μg·mL-1），然后取100 μL 待測(cè)液與400 μL 水和500 μL Folin-酚混合避光2 min 后加入2 mL 7.5% Na2CO3溶液，于40 ℃孵育30 min，測(cè)定760 nm 處吸光值；后用同樣方法測(cè)5 mg·mL-1COW 的吸光值。

（3）采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測(cè)總黃酮含量[4]。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照建標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制不同濃度梯度的蘆丁溶液為待測(cè)液（0 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1和250 μg·mL-1），然后取100 μL 待測(cè)液與100 μL 5% NaNO2溶液混合，5 min后加入100 μL 10% Al(NO3)3溶液，5 min 后加入400 μL 4.3% NaOH 溶液室溫5 min，測(cè)定510 nm 處吸光值；后用同樣方法測(cè)5 mg·mL-1COW 的吸光值。

1.2.3 COW 的抗氧化能力

將COW 配制成1.00 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1待測(cè)液。50 μL 待測(cè)液與150 μL 140 μg·mL-1DPPH·混合常溫避光30 min，測(cè)定517 nm 吸光度，以抗壞血酸（Vc）為陽(yáng)性對(duì)照[4]。DPPH·清除率按公式（1）計(jì)算。

將5 mL 7 mmol·L-1ABTS 溶 液 和43 μL 140 mmol·L-1K2S2O8溶液混合避光16 h，后用水稀釋至在734 nm 處的吸光值為0.700±0.020 時(shí)即配成ABTS 工作液。25 μL 待測(cè)液和150 μL ABTS 工作液混合測(cè)定734 nm 吸光度，以Vc 為陽(yáng)性對(duì)照[4]。ABTS自由基清除率按公式（1）計(jì)算。

式中：A1為待測(cè)液與自由基混合測(cè)定的吸光度值；A0為無(wú)水乙醇代替自由基溶液測(cè)定的吸光度值；A2為用純水代替待測(cè)樣品與自由基混合測(cè)定的吸光度值。

1.2.4 COW 對(duì)HaCaT 細(xì)胞存活率的影響

將HaCaT 細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期即可進(jìn)行試驗(yàn)[1]。細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的濃度接種于96 孔板并培養(yǎng)24 h 后，將原有培養(yǎng)基按分組換為不同濃度COW 的DMEM培養(yǎng)基（10.0 mg·mL-1、8.0 mg·mL-1、6.5 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、3.5 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1和1.0 mg·mL-1）培養(yǎng)24 h，使用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率。測(cè)定時(shí)，每孔中分別加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，測(cè)定450 nm 處吸光值。每組的存活率由該組吸光值除以空白組（0 mg·mL-1COW）吸光值得到。

1.2.5 HaCaT 細(xì)胞光老化模型建立

HaCaT 細(xì)胞接種于96 孔板培養(yǎng)24 h 后將原有培養(yǎng)基替換為PBS，不同劑量UVB 輻射（62.433 2 mJ·cm-2、123.634 9 mJ·cm-2、261.676 7 mJ·cm-2、389.581 7 mJ·cm-2和643.399 1 mJ·cm-2）后將培養(yǎng)基替換成DMEM 培養(yǎng)24 h，細(xì)胞存活率測(cè)定同1.2.4。在Excel 中用“Forecast”公式算出細(xì)胞存活率為50%時(shí)的UVB 輻照強(qiáng)度（IC50）用于建模[1]。

1.2.6 COW 對(duì)UVB 誘導(dǎo)的光老化HaCaT 細(xì)胞存活率的影響

實(shí)驗(yàn)分為模型組（Model）、空白組（NC）、陽(yáng)性對(duì)照組（PC）和COW 高、中和低劑量組（CH、CM和CL）。Model、NC和PC在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，CH、CM 和CL 在含有1.00 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1和0.25 mg·mL-1COW 的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24 h 后將培養(yǎng)基替換為PBS，除NC 外其他組用354.128 mJ·cm-2的UVB 進(jìn)行輻射，后將PBS 換為DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，細(xì)胞存活率測(cè)定同1.2.4。

1.2.7 細(xì)胞氧化因子的檢測(cè)

每孔加入100 μL IP 細(xì)胞裂解液，待裂解液將細(xì)胞充分裂解后，將細(xì)胞裂解液收集起來(lái)。之后利用GSHPx、SOD 和MDA 檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)其活力和含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Graphpad Prism 9、SPSS Statistics 26 和Excel 2016 軟件進(jìn)行制圖和數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 COW 的總多糖、總多酚和總黃酮含量及其抗氧化能力

總多糖、總多酚和總黃酮回歸方程及線性系數(shù)如表1所示。COW 中三者含量分別為（870.51±15.66）μg·mg-1、（37.89±1.25）μg·mg-1和（11.97±0.27）μg·mg-1?？寡趸Y(jié)果表明COW 清除ABTS 自由基和DPPH 自由基的IC50為（50.19±0.22）mg Vc·g-1和（25.21±2.13）mg Vc·g-1。

表1 總多糖、總多酚和總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線表

2.2 UVB 和COW 對(duì)HaCaT 細(xì)胞存活率的影響

UVB 劑量越大細(xì)胞存活率越低（圖1a）。據(jù)“Foercast”函數(shù)算出UVB 對(duì)于細(xì)胞存活率的IC50值為（354.128 ± 71.93）mJ·cm-2，故選此強(qiáng)度構(gòu)建HaCaT 光老化模型。

圖1 不同劑量UVB 和COW 的HaCaT 細(xì)胞存活率圖

COW 濃度越高細(xì)胞存活率越低（圖1b）。COW濃度為1 mg·mL-1時(shí)細(xì)胞存活率為93.61%，可視為此濃度對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。故高、中和低劑量組COW 濃度設(shè)為1.00 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1和0.25 mg·mL-1。

2.3 COW 對(duì)UVB 所致光老化HaCaT 細(xì)胞存活率和氧化因子的影響

CH 和CM 均能顯著提高經(jīng)UVB 照射后的細(xì)胞存活率，CL 組高于Model 組但并不顯著（圖2）。CH、CM 和CL 組細(xì)胞存活率隨COW 濃度減小而下降，且CH 顯著高于CL。

圖2 不同分組的細(xì)胞存活率圖

較NC，Model 細(xì)胞GSH-Px 和SOD 活性顯著降低，MDA 含量顯著高于NC，GSH-Px 和SOD 活性隨COW 濃度增加而提高，MDA 含量隨COW 濃度增加而減少（圖3）。

圖3 不同分組的GSH-Px 和SOD 酶活性以及MDA 的含量圖

3 討論

生物體正常行使功能依賴于穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)，此狀態(tài)的平衡靠機(jī)體內(nèi)部的氧化還原系統(tǒng)來(lái)維持[5]。過(guò)量UVB 輻射破壞皮膚氧化還原平衡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1]。本研究發(fā)現(xiàn)COW 有抗氧化活性，故對(duì)COW 是否對(duì)UVB 所致HaCaT 光老化模型有保護(hù)作用進(jìn)行研究。

COW 能提高經(jīng)UVB 輻射后HaCaT 的SOD 和GSH-Px 活性，降低MDA 含量，從而增加細(xì)胞存活率（圖3）。黑枸杞水提物也可以提高UVB 照射后HaCaT 的存活率[1]，但對(duì)比發(fā)現(xiàn)山茱萸對(duì)UVB 所致HaCaT 光老化模型保護(hù)能力更加突出。1 mg·mL-1的COW 可將HaCaT 細(xì)胞存活率提升20%，而1 mg·mL-1黑枸杞水提物僅能提升16%，這為COW 作為抗UVB輻射產(chǎn)品原料提供了理論依據(jù)。

本研究只對(duì)COW 的抗UVB 功效進(jìn)行初步了解，有必要對(duì)山茱萸不同組分和單體進(jìn)行深入的研究，并從生化與細(xì)胞層面深入探究。

4 結(jié)論

通過(guò)超聲提取所獲得的COW 具有抗氧化能力，可明顯改善由UVB 輻射所致的HaCaT 細(xì)胞GSH-Px和SOD 酶活力下降以及MDA 含量升高，增強(qiáng)細(xì)胞的存活率，對(duì)HaCaT 光老化模型有保護(hù)作用。