朱荷青,瑪哈巴·肉孜,李瑩瑩,張潔,許赫,李甜甜,韓吉龍,彭夏雨,楊敏*

(1 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院,石河子 832000;2 新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站,烏魯木齊 830000)

絨山羊?qū)儆诘湫偷碾p毛動物,分為覆蓋體表的長毛和長毛下致密柔軟的羊絨,一簇羊絨由1至3個初級毛囊(Primary Hair Follicle,PHF)產(chǎn)生的長毛和6至15個次級毛囊(Secondary Hair Follicle,SHF)生成的絨毛組成[1-2],而次級毛囊會經(jīng)歷從生長期(anagen)至退行期(catagen)再到休止期(telogen)的周期性再生過程[3]。羊絨產(chǎn)業(yè)在我國畜牧業(yè)中占有重要地位,如何有效增加絨的產(chǎn)量一直是我國絨山羊種質(zhì)創(chuàng)新領(lǐng)域的研究熱點[4],近年來從分子水平解析次級毛囊周期性生長的機(jī)制變得十分重要。毛囊的生長發(fā)育是一個復(fù)雜的過程,涉及數(shù)個信號通路、基因和ncRNA的相互作用[5-6],如Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)、成纖維細(xì)胞生長因子FGFs(Fibroblast growing factors, FGFs)、轉(zhuǎn)化生長因子TGF(Transforming growth factor, TGF)、表皮生長因子EGF(Epidermal growth factor, EGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP(Bone morphogenetic protein, BMP)等[7-10],對調(diào)控因子的篩選和基因互作的研究一直是毛囊發(fā)育生物學(xué)研究的重點。

本課題組前期通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)含有C2的冷休克結(jié)構(gòu)域(cold shock domain containing C2, CSDC2)在毛囊的生長期高表達(dá),在休止期低表達(dá),經(jīng)小鼠皮膚組織驗證,使用siRNA干擾CSDC2能夠令毛囊發(fā)育關(guān)鍵基因Foxn1和Notch1的表達(dá)量降低[11],因此推測CSDC2參與絨山羊次級毛囊從生長旺盛期到休止期的調(diào)控過程,但該假設(shè)仍需進(jìn)一步的實驗分析。CSDC2是一種廣泛存在于原核和真核生物中的高度保守的RNA結(jié)合蛋白(RNA Binding Protein,RBP),RBPs與癌細(xì)胞的增殖和分化有關(guān),研究表明CSDC2的啟動子內(nèi)存在一個編碼miR-373的位點,miR-373 能與CSDC2的啟動子序列互補(bǔ)結(jié)合[12-15],所以本研究擬采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation, ChIP)尋找CSDC2的下游調(diào)控基因,探索該基因參與毛囊周期性調(diào)控的機(jī)制。而ChIP最重要的一步即特異性抗體的選擇,因此制備有效的特異性抗體尤為重要?；诖吮狙芯渴褂蒙欧治鍪侄魏Y選出CSDC2的免疫優(yōu)勢肽段并制備多克隆抗體,同時利用免疫印跡檢測抗體的特異性,為進(jìn)一步利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)探索該轉(zhuǎn)錄因子在毛囊周期性生長中的分子機(jī)制提供條件。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試劑

實驗級日本大耳白兔,雌性,6～8周齡,體重1 kg。新疆絨山羊,雄性,3周歲,飼養(yǎng)于石河子大學(xué)動物科技學(xué)院實驗站。完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、TMB 顯色液購自Sigma;脫脂奶粉、HRP-羊抗兔 IgG、PVDF膜、1×TBST、高效RIPA裂解液、PAGE彩膠快速配成試劑盒、ECL顯色液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 CSDC2蛋白的生物信息學(xué)分析

從UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)獲取山羊的CSDC2全長氨基酸序列(A0A452FJD6),采用在線二級結(jié)構(gòu)分析軟件SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和Predictprotein(https://predictprotein.org/)共同預(yù)測二級結(jié)構(gòu);使用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測CSDC2蛋白的三級結(jié)構(gòu);使用Expasy中的ProtParam 蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析工具(https://web.expasy.org/protparam/)分析CSDC2 蛋白的基本理化性質(zhì)和親水系數(shù);使用在線工具ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)繪制CSDC2蛋白的親疏水性圖譜;利用DNAstar的Protean程序分析CSDC2蛋白的抗原指數(shù)、表面可及性、柔韌性;使用TMHHM 2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)分析預(yù)測CSDC2的跨膜結(jié)構(gòu);使用SignalP 5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)預(yù)測CSDC2蛋白的信號肽;使用NetPhos 3.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)在線預(yù)測CSDC2蛋白的磷酸化位點。

1.3 CSDC2蛋白的抗原表位篩選

應(yīng)用在線分析軟件SVMTriP(http://sysbio.unl.edu/SVMTriP/prediction.php)對CSDC2的抗原表位進(jìn)行預(yù)測,同時綜合生信分析結(jié)果篩選出該蛋白的免疫優(yōu)勢肽段。

1.4 動物免疫、抗血清 ELISA 檢測及純化

將篩選的N-端氨基酸序列肽段(HSPKSPVWPTFPFHREGSR, aa 15-33)交送武漢愛基百客生物科技有限公司進(jìn)行多肽合成和鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián),于第1、12、26、40、54 d免疫1只SPF級日本大耳白兔,白兔編號E1,于實驗前采集白兔血清作為陰性對照。首次免疫佐劑采用完全弗氏佐劑,第 2～5 次免疫采用不完全弗氏佐劑,在免疫前將佐劑與抗原等量混勻并充分乳化,首次免疫劑量為0.7 mg,第 2～5 次免疫劑量為0.35 mg,于初次免疫后第66 d頸動脈采血,4 ℃,1 500 g 離心 20 min,收集上層血清于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將無偶聯(lián) KLH多肽抗原與包被液按1∶8 000稀釋后,每孔100 μL加入96孔板中,4 ℃放置過夜。PBST-5%脫脂奶粉室溫封閉 0.5 h后洗滌3次;每孔加入第 66 d白兔免疫血清(按 1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶50 000、1∶100 000 、1∶200 000稀釋),37 ℃孵育1 h;PBST 洗滌 3 次,加入 1∶8 000稀釋HRP-羊抗兔 IgG,37 ℃孵育1 h;每孔加入100 μL TMB顯色液,室溫暗處放置15 min,加入 50 μL終止液,拍照記錄。抗血清用HSPKSPVWPTFPFHREGSR-C 作抗原親和純化得到濃縮后的抗體,標(biāo)記為E1。

1.5 抗體特異性的檢測

采集處于絨山羊生長期的皮膚組織(7月),在羊體右側(cè)肩胛骨后沿背中線與腹中線的上1/3處剪去絨和毛,裸露的皮膚用75%酒精消毒,使用無菌醫(yī)用手術(shù)剪剪取1 cm2皮膚組織,迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

將皮膚組織樣本使用RIPA裂解液(含 1 μL PMSF)于冰上提取總蛋白,每 10 min 搖勻 1 次,共 3 次;放入 4 ℃離心機(jī) 12 000 g離心10 min,取上清。SDS-PAGE電泳濃縮膠濃度5%,電壓80 V;分離膠濃度12%,恒定電壓150 V。使用0.45 μm 孔徑的 PVDF 膜恒流 200 mA濕轉(zhuǎn)30 min,含 5%(W/V)脫脂牛奶 TBST室溫封閉4 h。以制備的兔抗CSDC2蛋白多克隆抗體(稀釋比1∶1 000)為一抗4 ℃過夜孵育,HRP-羊抗兔 IgG (稀釋比1∶8 000)作為二抗37 ℃孵育1 h,ECL顯色后拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 CSDC2蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測

CSDC2蛋白由153個氨基酸構(gòu)成,相對分子質(zhì)量為16 757.86,等電點(PI)為7.01,氨基酸序列如圖1。CSDC2蛋白的N末端是Met,在體外培養(yǎng)的哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h,在酵母中大于20 h,在大腸桿菌中大于10 h。

圖1 CSDC2 蛋白的氨基酸序列

蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析軟件SOPMA和Predictprotein預(yù)測結(jié)果如圖2所示,可以看出無規(guī)則卷曲在該蛋白質(zhì)中占比最高,α-螺旋和β-折疊相對較少。使用SOPMA(圖2A)預(yù)測α-螺旋13(8.5%)、β-折疊14(9.15%)、無規(guī)則卷曲92(60.13%)、延伸鏈34(22.22%)。使用Predictprotein(圖2B)預(yù)測α-螺旋6(3.9%)、β-折疊39(25.5%)、無規(guī)則卷曲108(70.5%)。取兩種方法中預(yù)測一致的重疊區(qū),無規(guī)則卷曲主要分布于N-端氨基酸序列的第1～58、146～153位。三級結(jié)構(gòu)SWISS-MODEL預(yù)測結(jié)果見圖2C。

A:SOPMA預(yù)測結(jié)果,h為α-螺旋,t為β-折疊,c為無規(guī)則卷曲,e為延伸鏈;B:Predictprotein預(yù)測結(jié)果;C:CSDC2蛋白的三級結(jié)構(gòu)。圖2 CSDC2的蛋白結(jié)構(gòu)

2.2 CSDC2蛋白的理化性質(zhì)

利用ProtParam分析得出CSDC2蛋白的脂溶指數(shù)為61.63,平均親水系數(shù)為 -0.493,親/疏水性圖譜如圖3A所示,第33位(精氨酸,Arg)為CSDC2蛋白中最親水的氨基酸位點,得分為 -2.044,第131位(谷氨酸,Glu)為該蛋白中最疏水的位點,得分為1.478,說明CSDC2蛋白屬于親水性蛋白。CSDC2蛋白的抗原指數(shù)、表面可及性、柔韌性分析結(jié)果見圖3B,該蛋白的柔性區(qū)域主要集中于氨基酸序列的12-53 aa,在5-9 aa、12-22 aa、29-34 aa、36-57 aa、65-68 aa、76-82 aa、86-93 aa、100-104 aa、109-113 aa、121-126 aa、141-150 aa散在分布?？乖笖?shù)評分較高的區(qū)域為第1-9、14-21、27-57、61-67、72-82、86-95、99-115、120-130、140-148位氨基酸,柔性較高的區(qū)域與抗原指數(shù)得分高的區(qū)域基本一致。表面可及性得分較高的區(qū)域為2-7 aa、14-18 aa、27-31 aa、42-57 aa、76-81 aa、121-126 aa、140-145 aa。使用TMHHM 2.0預(yù)測CSDC2跨膜結(jié)構(gòu)如圖3C所示,無跨膜結(jié)構(gòu)域并完全位于膜內(nèi)。

A:ProtParam的疏水性分析結(jié)果;B:Protean的理化性質(zhì)分析結(jié)果,藍(lán)色條為柔韌性較高的區(qū)域,粉色峰為抗原指數(shù),黃色峰為表面可及性;C:CSDC2的跨膜結(jié)構(gòu)分析。圖3 CSDC2的親疏水性、抗原指數(shù)、表面可及性、柔韌性及跨膜結(jié)構(gòu)

2.3 信號肽及磷酸化位點預(yù)測

信號肽及磷酸化位點預(yù)測見圖4。

A:SignalP 5.0的信號肽預(yù)測結(jié)果;B:NetPhos 3.1的磷酸化位點預(yù)測結(jié)果。圖4 CSDC2的信號肽及磷酸化位點

SignalP 5.0在線軟件預(yù)測顯示CSDC2無信號肽,應(yīng)用NetPhos 3.1在線軟件預(yù)測CSDC2蛋白的磷酸化位點,設(shè)置閾值高于0.5的為潛在磷酸化位點,該蛋白在第3、16、19、32、39、41、47、58、64、79位絲氨酸處,第2、6、24、51、54、56、60、86、114、141位蘇氨酸處,第105、115位酪氨酸處發(fā)生磷酸化,結(jié)果見圖4。

2.4 CSDC2蛋白抗原表位的預(yù)測

使用SVMTriP在線分析軟件預(yù)測CSDC2的抗原表位,表位長度設(shè)置為20 aa,結(jié)果見表1。綜合二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果、基本理化性質(zhì)及抗原表位預(yù)測結(jié)果,選擇蛋白-N端15-33 aa(HSPKSPVWPTFPFHREGSR)合成多肽HSPKSPVWPTFPFHREGSR-C。

表1 SVMTriP預(yù)測CSDC2抗原表位得分表

2.5 抗血清ELISA檢測、純化

濃縮后抗體濃度為2.70 mg·mL-1,間接ELISA檢測結(jié)果見圖5,每行包被100 μg·μL-1的五免血清,抗體濃度正常,效價良好。

圖5 抗血清ELISA檢測

2.6 抗體特異性檢測結(jié)果

為確定抗體是否可以用于ChIP實驗,使用從絨山羊皮膚組織中提取的總蛋白,以純化后的抗體作為一抗檢測抗體的特異性,Western blot結(jié)果見圖6。CSDC2蛋白的相對分子質(zhì)量約為17 kD,在15 ～ 20 kD處有條帶。

M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: CSDC2蛋白的ECL顯色。圖6 絨山羊皮膚組織蛋白的western blot鑒定

3 討論

特異性抗體在人類和動物的功能基因研究中被廣泛應(yīng)用并具有重要作用,但獲得特異性強(qiáng)、高效價的抗體一直較為困難,而多克隆抗體以方法簡單、成本低成為抗體制備的首選[16-17]。CSDC2由一個含有RNP1和RNP2基序的CSD以及兩個能夠結(jié)合雙鏈RNA的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,目前國內(nèi)外對于CSDC2的功能研究仍較少,有研究表明CSDC2在錐體神經(jīng)元的終末分化中起到促進(jìn)作用,同時CSDC2是造成小鼠子宮UIII細(xì)胞蛻膜的主要調(diào)節(jié)因子,在卵巢激素的作用下參與胚胎與子宮內(nèi)膜的信號交流[18-19],說明CSDC2在細(xì)胞增殖分化過程中具有重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn),CSDC2作為重要的轉(zhuǎn)錄因子在絨山羊皮膚組織中隨絨毛生長呈周期性表達(dá),且發(fā)現(xiàn)生長期高表達(dá),休止期地表達(dá),說明CSDC2在絨山羊絨毛周期性調(diào)控中其重要作用,本研究推測CSDC2通過調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)靶基因的表達(dá)在絨山羊毛囊周期性生長中參與調(diào)控。

為制備絨山羊CSDC2特異性抗體,本研究通過在線分析軟件分別對CSDC2蛋白的結(jié)構(gòu)、親/疏水性、抗原指數(shù)、表面可及性、柔韌性、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽、磷酸化位點、抗原決定簇和抗原表位進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果顯示CSDC2 蛋白編碼157個氨基酸且無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽,同時CSDC2蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為51.65,大于閾值40,說明CSDC2屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì),而該蛋白的平均親水系數(shù)為 -0.493,表明CSDC2蛋白是一個位于細(xì)胞核內(nèi),在細(xì)胞質(zhì)中作用的不穩(wěn)定親水蛋白。CSDC2具有22處磷酸化位點,根據(jù)抗原表位的得分并結(jié)合抗理化性質(zhì)的分析,CSDC2蛋白在第15-33位氨基酸顯示出良好的柔韌性、抗原性、表面可及性和親水性,在二級結(jié)構(gòu)上該段氨基酸位于無規(guī)則卷曲區(qū)域內(nèi),推測是可能的 B 細(xì)胞線性肽段位置,因此本研究將該段氨基酸選為免疫試驗兔的優(yōu)勢肽段。本研究得到的抗血清的效價較好,同時通過Western blot檢測抗體的特異性,選取CSDC2高表達(dá)的絨山羊皮膚組織提取總蛋白后進(jìn)行抗體孵育,結(jié)果顯示條帶大約在17 kD處,即說明本研究制備的多克隆抗體具有一定準(zhǔn)確性和生物學(xué)效價,可以與CSDC2蛋白特異性結(jié)合。

CSDC2作為轉(zhuǎn)錄因子中的重要一員,關(guān)于其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究幾乎為空白,其特異性調(diào)控絨山羊絨毛周期性生長過程中的靶基因仍不明確。目前研究轉(zhuǎn)錄因子分子機(jī)制的研究方法包括ChIP-Seq,EMSA等,作為尋找轉(zhuǎn)錄因子的靶基因的有效手段,ChIP通過特異性抗體捕獲蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物,是目前研究蛋白質(zhì)和DNA互作的主流技術(shù)[20-21]。隨著家畜功能基因和后基因組學(xué)的研究不斷深入,商業(yè)化抗體的種類逐漸增多,但多數(shù)抗體僅可用于人類或模式動物如小鼠的研究,國內(nèi)外在家畜的目的蛋白商業(yè)化特異性抗體制備方面依然不夠豐富[22],因此如何設(shè)計制作符合要求的特異性抗體從而驗證目的基因和蛋白在家畜重要表型性狀中的作用機(jī)制是十分重要的。本研究選擇合適的多肽片段免疫試驗兔并最終得到為后續(xù)免疫共沉淀實驗所用的多克隆抗體,為CSDC2基因功能的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

由此可知,本研究得出絨山羊CSDC2的免疫優(yōu)勢肽段為15～33 aa(HSPKSPVWPTFPFHREGSR)并免疫試驗兔制備了多克隆抗體,進(jìn)一步實驗證明該抗體具有較好生物學(xué)效價,為后續(xù)深入研究CSDC2在絨山羊絨毛周期性生長調(diào)控的作用奠定了理論基礎(chǔ)。