歐國棟?肖建光?賴珊?洪建文

摘要：目的 對注射用亞胺培南西司他丁鈉的無菌檢查方法進行優(yōu)化及確認。方法? ? 依據(jù)《中國藥典》2020版四部通則1101無菌檢查法，對供試液、敏感菌、沖洗量和中和劑等可能的影響因素進行了探討，并在供試液配制，濾膜，沖洗量及沖洗次數(shù)、中和劑及其使用量、陽性對照菌等方面對注射用亞胺培南西司他丁鈉的無菌檢查方法進行優(yōu)化。結(jié)果 選取4個廠家樣品對注射用亞胺培南西司他丁鈉的無菌檢查方法進行確認， 6株陽性試驗菌在規(guī)定時間內(nèi)都生長良好。結(jié)論 該方法能有效去除注射用亞胺培南西司他丁鈉的抑菌性，具有操作簡便，高效可靠等優(yōu)點，適用于注射用亞胺培南西司他丁鈉上市抽驗樣品和批出廠產(chǎn)品的無菌檢查。

關(guān)鍵詞：注射用亞胺培南西司他丁鈉；無菌檢查法；金屬酶；方法適用性試驗

中圖分類號：R978.1文獻標(biāo)志碼：A

Abstract Objective To improve and confirm the sterility test method of imipenem and cilastation sodium for injection. Methods According to the sterility test method in general rule 1101 of Chinese Pharmacopoeia （2020 Edition）， The factors that might influence such as the test solution， sensitive bacteria， flushing amount and neutralizer， etc were explored， and the sterility test method of imipenem and cilastation sodium for injection was optimized in the aspects of test solution preparation， filter membrane， flushing amount and flushing times， neutralizer and its use amount， positive control bacteria， etc. Results The samples of four manufacturers were selected to confirm the sterility test method of imipenem and cilastation sodium for injection， Six positive test bacteria grew well within the specified time. Conclusion The optimized and standardized method can effectively eliminate bacteriostasis of mipenem and cilastation sodium for injection，and has the advantages of simple operation， high efficiency and reliability，it is suitable for the sterility test of imipenem and cilastation sodium for injection for market sampling and batch products.

Key words Imipenem and cilastation sodium for injection; Sterility test; Metalloenzyme; Method applicability test

注射用亞胺培南西司他丁鈉是由碳青霉烯類抗生素亞胺培南和腎肽酶抑制劑西司他丁鈉按1：1比例組成的一種復(fù)合制劑[1]，屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素的硫霉素類抗生素，具有抗菌譜廣和抗菌活性強的特點[2-3]，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌均有抑制作用[4]。1985年在日本上市[5]，現(xiàn)國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)和進口企業(yè)均為5家，市售規(guī)格有0.5、1.0和2.0 g，臨床上常用于治療多種病原體所致與需厭氧菌導(dǎo)致的混合感染[6]。

注射用亞胺培南西司他丁鈉是2022年國家藥品抽驗品種，共計抽檢80批次，來自22個省級行政區(qū)，涉及8家企業(yè)和2個規(guī)格。在無菌檢驗過程中發(fā)現(xiàn)，8家企業(yè)均采用了薄膜過濾法聯(lián)用中和劑的方法，但采用的無菌檢查的方法不盡相同，且存在不一致或需改進的地方，和其它抗生素品種無菌檢驗中發(fā)現(xiàn)的情況相似[7]，普遍表現(xiàn)在敏感菌選擇、供試液配制、沖洗量及中和劑選擇和用量等方面[8-9]，對其無菌檢查方法進行統(tǒng)計對比，結(jié)果見表1。

由表1可見，各廠家無菌檢查方法中不僅存在敏感菌選擇不一致和沖洗量過大的問題，而且在供試液配制方面還存在稀釋液使用量不夠和操作繁瑣的問題，這既不利于樣品的充分溶解，也限制了在無菌檢查用隔離系統(tǒng)中檢查（如水浴）；在中和劑使用方面還有一半廠家選擇青霉素酶作為中和劑，而選擇金屬酶的個別廠家直接以最低標(biāo)示酶活性使用，未能按實際酶活性并根據(jù)需要配制成相應(yīng)濃度，使用量大易造成浪費，不利于降低檢驗成本。為了提升無菌檢查的可靠性、準(zhǔn)確性和效率，節(jié)約資源，本文采用薄膜過濾法，通過合理選擇中和劑，優(yōu)化并統(tǒng)一了注射用亞胺培南西司他丁鈉的無菌檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 設(shè)備和耗材

GF88DA立式自動壓力蒸汽滅菌器（致微（廈門）儀器有限公司）；1379生物安全柜（賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司）；BRE240生化培養(yǎng)箱（Froilabo公司）；HTY-602集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）；NS01-75D1T薄膜過濾器（北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司）；KDGB220D、KDGB330D集菌培養(yǎng)器（浙江泰林生命科學(xué)有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB，批號：1091021），硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FTM，批號：1100095），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號：1111461），以上培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基（批號：210224），胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號：220412），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號：220223），以上培養(yǎng)基購自北京三藥科技開發(fā)公司。培養(yǎng)基的無菌性檢查和靈敏度檢查均符合規(guī)定。

0.9%無菌氯化鈉溶液（廣州化學(xué)試劑廠，批號：20210902 19） ，0.1%無菌蛋白胨水溶液（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：1100901），金屬β-內(nèi)酰胺酶（金屬酶，杭州北望生物技術(shù)有限公司，批號：6022248D，規(guī)格：≥200萬單位/支，酶活性為216.38萬單位/支）；青霉素酶（杭州北望生物技術(shù)有限公司，批號：6012190D，規(guī)格：1000萬單位/支，酶活性為1606.51萬單位/支）。

1.3 試藥

注射用亞胺培南西司他丁鈉，規(guī)格：1.0 g（亞胺培南0.5 g和西司他丁0.5 g），來自國產(chǎn)企業(yè)3家和進口企業(yè)1家，分別以代碼表示為 A （批號：220320809、211120803、211120801、210920801、220320802），B （批號：21088211、21105811、21038711），C（批號：2112038、2112035、2106022），D （批號：U035730、U028209、U027236）。

1.4 菌種

大腸埃希菌 [CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、生孢梭菌 [CMCC（B）64941]、枯草芽胞桿菌[CMCC（B）63501]、白念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉 [CMCC（F）98003] [10]，均購自中國食品藥品檢定研究院，工作用菌株為第三代。

2 方法

2.1 菌液制備

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草芽胞桿菌、白念珠菌和黑曲霉，按照《中國藥典》2020年版四部通則1101的要求，制備成不大于l00 cfu/mL的菌懸液或者孢子懸液[11]。

2.2 供試液制備

取樣品[規(guī)格：1.0 g（亞胺培南0.5 g和西司他丁0.5 g）]5支，用0.9%無菌氯化鈉溶液溶解并稀釋至

500 mL，制成含亞胺培南5 mg/mL的供試品溶液。

2.3 預(yù)試驗

2.3.1 敏感菌的選擇[12]

取菌懸液或孢子懸液各1 mL，分別加入不同無菌平皿中，再各加入“2.2”項下溶液0.1 mL，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌立即傾注TSA15～20 mL；白念珠菌、黑曲霉立即傾注SDA15～20 mL，每一試驗菌株平行制備兩個平皿，作為試驗組；同上法操作，分別制作菌液組和稀釋劑對照組。

取“2.2”項下溶液1mL按薄膜過濾法過濾，用300 mL 0.1%無菌蛋白胨水溶液進行沖洗，在最后一次分別加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌菌懸液各1 mL，取出濾膜貼于TSA平板上，作為試驗組; 同上法操作，分別制作菌液組和稀釋劑對照組。

2.3.2 沖洗量的考察

取KDGB220D集菌培養(yǎng)器3套，每個濾筒取“2.2”項下溶液500 mL過膜，再用0.1% 無菌蛋白胨水溶液按100 mL/膜/次進行沖洗，每個濾筒的總沖洗量分別為300、500、700 mL，在最后一次沖洗液中分別加入菌懸液1 mL，沖洗完后分別加入

100 mL FTM或100 mL TSB，陽性對照：另取濾筒不加入樣品溶液，其它操作同上。陰性對照：另取濾筒不加入樣品溶液和試驗菌，其它操作同上。

2.3.3 中和劑及其用量的考察

有文獻[13]指出頭孢菌素酶對碳青霉烯類（培南類） 中和作用較弱，故考慮分別使用金屬酶和青霉素酶進行方法考察。取KDGB220D集菌培養(yǎng)器2套，每個濾筒取“2.2”項下溶液500 mL過膜，再用0.1% 無菌蛋白胨水溶液按100 mL/膜/次進行沖洗，每個濾筒的總沖洗量分別為300 mL，在最后一次沖洗液中分別加入菌懸液1 mL，沖洗完后分別加入100 mL含25或50萬單位金屬酶的FTM，以及100 mL含25或50萬單位金屬酶的TSB，陽性對照：另取濾筒不加入樣品溶液，其它操作同上。陰性對照：另取濾筒不加入樣品溶液和試驗菌，其它操作同上。

再取KDGB220D集菌培養(yǎng)器3套和另3家企業(yè)的樣品適量，沖洗完后每100 mL培養(yǎng)基中分別加入25萬單位金屬酶，其它操作同上。

另取KDGB220D集菌培養(yǎng)器8套，沖洗完后每100 mL培養(yǎng)基中分別加入300或600萬單位青霉素酶，其它操作同上。

2.4 無菌檢查方法確認實驗

選取4個廠家樣品適量，分別對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、生孢梭菌、白念珠菌、黑曲霉6個菌株進行考察確認。取KDGB330D集菌培養(yǎng)器8套，每個濾筒取“2.2”項下溶液

500 mL過膜，再用0.1%無菌蛋白胨水溶液按100 mL/膜/次進行沖洗，每個濾筒的總沖洗量為300 mL，在最后一次沖洗液中分別加入菌懸液或孢子懸液

1 mL，沖洗完后分別加入100 mL含25萬單位金屬酶的FTM或100 mL含25萬單位金屬酶的TSB，陽性對照：另取濾筒不加入樣品溶液，其它操作同上。陰性對照：另取濾筒不加入樣品溶液和試驗菌，其它操作同上。結(jié)果見表2。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果

3.1.1 試驗關(guān)鍵影響因素的探討

抗生素類藥品無菌檢查結(jié)果的準(zhǔn)確與否關(guān)鍵是無菌檢查過程中對其抑菌性的有效消除[14]，常見消除抑菌活性的方式有：增加稀釋液或培養(yǎng)基體積、加入適宜的中和劑或滅活劑、薄膜過濾法[15]等。注射用亞胺培南西司他丁鈉屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，抗菌活性強及抗菌譜廣。本文采用以上幾種方式聯(lián)合使用的方法，對影響該品種無菌檢查法的關(guān)鍵因素進行了確認。

（1）供試液配制和濾膜選擇? ? 注射用亞胺培南西司他丁鈉是難溶性抗菌藥物[17]，選擇合適的稀釋劑配制成合適的供試液濃度很重要。經(jīng)查文獻，取適量樣品用0.9%無菌氯化鈉溶液溶制成含亞胺培南

5 mg/mL的供試品溶液，可在3 min內(nèi)完全溶解，有利于減少濾膜對抑菌成分的吸附，還可降低后續(xù)沖洗量。本次研究采用了低吸附性的尼龍膜材質(zhì)濾膜，適合強抑菌性的抗生素藥物。

（2）陽性對照菌確認? ? 注射用亞胺培南西司他丁鈉是廣譜抗菌藥，從“2.3.1”項下的結(jié)果可知，平皿法結(jié)果金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌的回收率均為0，白念珠菌和黑曲霉回收率的回收率分別為98%、85%，說明注射用亞胺培南西司他丁鈉對細菌有很強的抑菌作用，對真菌幾無抑菌性。薄膜過濾法結(jié)果金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌的回收率分別為38%、69%、47%，可見金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌對本品敏感。根據(jù)《中國藥典》要求，抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌。故本文選擇了同為革蘭陽性菌但更為敏感的金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌。

（3）沖洗量的選擇? ? 《中國藥典》2020版四部規(guī)定，如供試品具有抑菌作用，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)一般不少于3次?？倹_洗量一般不超過500 mL，最高不得超過1000 mL。而USP-NF2021有更嚴(yán)格的規(guī)定，每張濾膜均不得沖洗超過5次，每次100 mL，即使方法適用性試驗表明該沖洗方法不能完全清除供試品抑菌性，也不必增加沖洗次數(shù)[18]。

由“2.3.2”項下的結(jié)果可知，當(dāng)沖洗液用量為300 mL和500 mL時，金黃色葡萄球菌1 d后生長良好，而枯草芽胞桿菌培養(yǎng)5 d后都未能正常生長；當(dāng)沖洗量為700 mL 時，1 d后兩種試驗菌均生長良好，說明當(dāng)采用薄膜過濾法，每膜沖洗量為700 mL時可以消除注射用亞胺培南西司他丁鈉的抑菌性，但增加沖洗量和沖洗次數(shù)會使濾膜上的微生物損傷導(dǎo)致假陰性，故考慮采用沖洗量300 mL添加中和劑的方法進行考察。

（4）中和劑及其用量的選擇? ? 注射用亞胺培南西司他丁鈉可選用β-內(nèi)酰胺酶去除其抗菌活性，排除其對無菌檢查結(jié)果的影響。本次研究采用青霉素酶和金屬酶作為中和劑進行比較，由“2.3.3”項下的結(jié)果可見，當(dāng)沖洗液用量為300 mL時，在培養(yǎng)基中添加25萬單位金屬酶，1 d后2種試驗菌均生長良好；使用同等體積沖洗液，在培養(yǎng)基中添加300萬單位青霉素酶，樣品B和C的枯草芽胞桿菌培養(yǎng)5 d后都未能正常生長；在培養(yǎng)基中添加600萬單位青霉素酶，1天后兩種試驗菌都生長良好。以上數(shù)據(jù)說明在沖洗量一致的情況下，25萬單位金屬酶與600萬單位青霉素酶均可有效去除抑菌成分。因金屬酶有效使用量比青霉素酶低，且有文獻[19-22]報道金屬酶通過水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的內(nèi)酰胺環(huán)使之失活，能更為有效分解碳青霉烯類（如培南類）和除單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素之外的幾乎所有其他β-內(nèi)酰胺類抗生素，作用譜范圍更廣泛，故首選它作為中和劑。

3.1.2 無菌檢查方法的確認結(jié)果

注射用亞胺培南西司他丁鈉的無菌檢查方法確認實驗結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，與對照管比較，在規(guī)定培養(yǎng)時間內(nèi)，6個菌株的生長情況良好，說明該方法適用于注射用亞胺培南西司他丁鈉的無菌檢查。

3.1.3 優(yōu)化的無菌檢查方法

整理方法如下：取樣品[規(guī)格： 1.0g（亞胺培南0.5g和西司他丁0.5 g）]15支，每5支用0.9%無菌氯化鈉溶液溶解并稀釋至500 mL，制成含亞胺培南5 mg/mL的供試品溶液，按薄膜過濾法過濾，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，按100 mL/膜/次，沖洗3次，沖洗后在一管泵入100 mL含25萬單位金屬酶的TSB，另兩管分別泵入100 mL含25萬單位金屬酶的FTM，其中1管加入含菌數(shù)不大于100 cfu/mL的金黃色葡萄球菌作為陽性對照，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，依法檢查。

3.2 討論

2022年抽檢注射用亞胺培南西司他丁鈉共計80批次，涉及5家國產(chǎn)企業(yè)和3家進口企業(yè)，包括0.5 g和1.0 g兩個規(guī)格；其中樣品A～D約占總批次的86%，規(guī)格為1.0 g的樣品占80%。故選取A～D四個廠家規(guī)格為1.0 g的樣品，按5g/膜進行試驗；而根據(jù)《中國藥典》2020版四部1101表1和表3的要求，對于規(guī)格為300 mg≤M≤5 g的樣品，每膜過濾樣品量不低于3 g即符合要求，所以建立的無菌檢查方法也適用于0.5 g

和2.0 g兩個規(guī)格。

針對表1存在的問題，本文對注射用亞胺培南西司他丁鈉無菌檢查法進行了優(yōu)化。研究采用對該品種較為敏感的金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌作為試驗菌，分別對沖洗量、中和劑及其用量等關(guān)鍵影響因素進行考察，最終確認以0.1%無菌蛋白胨水溶液300 mL分3次沖洗濾膜，每100 mL培養(yǎng)基中添加金屬酶25萬單位作為無菌檢查方法，結(jié)果試驗組與陽性對照組均生長良好。該方法既保證了結(jié)果的可靠有效，同時降低了檢驗成本，提高了檢驗效率，也為該品種不同規(guī)格的注射劑無菌檢查法提供了借鑒，有利于實現(xiàn)資源共享。

參 考 文 獻

劉婷婷， 王先利. 注射用亞胺培南西司他丁鈉致產(chǎn)褥感染患者粒細胞缺乏1例[J]. 中國臨床藥學(xué)雜志， 2021， 30（6）： 465-468.

徐運娥， 盧忠義， 敖弟書， 等. 亞抑菌濃度亞胺培南西司他丁鈉誘導(dǎo)銅綠假單胞菌生物被膜形成的體外研究[J].遵義醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2022， 45（4）： 433-437.

王芳， 周秋云， 魯濤. 亞胺培南西司他丁鈉或美羅培南治療早期肺癌合并重癥肺部感染[J].中國臨床研究， 2022， 35（9）： 1305-1309.

曹娟， 馮瓊. 谷氨酰胺聯(lián)合亞胺培南治療重癥急性胰腺炎合并感染的臨床效果及對炎癥因子的影響[J]. 臨床醫(yī)學(xué)研究與實踐， 2022， 7（27）： 38-41.

艾效曼， 陶鳳蓉， 賴惠英， 等. 比阿培南等10 種抗菌藥物對常見革蘭陰性桿菌體外抗菌活性比較[J]. 中國新藥雜志， 2020， 29（5）： 541-546.

李恒杰. 亞胺培南西司他丁鈉與美羅培南治療重癥細菌感染的對比研究[J]. 黑龍江醫(yī)學(xué)， 2022， 46（16）： 1978-1980.

劉荔， 田妮娜， 張曉萍， 等. 對不同廠家生產(chǎn)的氯霉素滴眼液無菌檢查法的確定[J]. 甘肅科技， 2018， 34（10）： 31-32， 50.

肖建光， 歐國棟， 賴珊， 等. 注射用頭孢尼西鈉無菌檢查方法的優(yōu)化及關(guān)鍵影響因素[J]. 中國抗生素雜志， 2021， 46（4）： 287-290.

劉洪祥， 劉海玲， 解慧， 等. 注射用替加環(huán)素?zé)o菌檢查的研究及優(yōu)化[J]. 藥物分析雜志， 2020， 40（8）： 1443-1450.

劉荔， 田妮娜， 朱仁愿， 等. 注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉（2：1）無菌檢查法的研究[J]. 甘肅科技， 2019， 35（6）： 94-95.

李婭男， 李偉， 曹曉云. 注射用硫酸頭孢匹羅無菌檢查法的確定[J]. 天津藥學(xué)， 2019， 31（6）： 31-33.

石蓉， 彭詩富. 注射用甲磺酸培氟沙星無菌檢查方法改進及驗證[J]. 海峽藥學(xué)， 2020， 32（3）： 91-93.

吳揚， 余輝， 沈祝飛， 等. 衛(wèi)生學(xué)檢查中和劑頭孢菌素酶作用范圍研究[J]. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報（ 自然科學(xué)版）， 2016， 32（4）： 433-434.

傅莉萍， 王朝麗， 李婷， 等. 氨曲南及其注射劑無菌檢查方法適用性試驗[J]. 藥學(xué)服務(wù)與研究， 2021， 21（6）： 419-423.

潘海虹， 徐有斌. 抑菌性藥品的微生物檢查與分析[J]. 化工管理， 2019， 11： 182-183.

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2020年版.四部 [S]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020： 156-160.

周亞林， 林碧英， 葉少霞. 某院難溶性抗菌藥物的配制分析[J]. 中國醫(yī)藥指南， 2020， 18（34）： 238-239.

李玉立， 江志杰， 劉文杰， 等. 中美現(xiàn)行藥典無菌檢查法比對[J]. 中國藥業(yè)， 2022， 31（8）： 6-9.

吳揚， 文靜， 王鑫， 等. 探討無菌檢查中和劑β-內(nèi)酰胺酶IV的作用范圍及水解效果[J]. 國外醫(yī)藥抗生素分冊， 2019， 40（4）： 390-391.

卞聰， 馬貝貝， 胡來興， 等. 金屬碳青霉烯酶的作用機制及其抑制劑研究進展[J]. 中國抗生素雜志， 2017， 42（11）： 923-931.

韓江雪， 劉憶霜， 肖春玲. β-內(nèi)酰胺酶抑制劑研究進展[J]. 中國抗生素雜志， 2019， 44（6）： 647-653.

周海英， 曹原， 鄧勁， 等. 氨曲南聯(lián)合頭孢他啶/阿維巴坦對產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌目細菌的體外協(xié)同作用初探[J]. 中國抗生素雜志， 2021， 46（8）： 784-788.