張艷萍,張 敏,周宗洲,黃婉鋒, 何作民

(1.廣東省佛山市食品藥品檢驗檢測中心,廣東 佛山 528051; 2.廣東省佛山市疾病預防控制中心,廣東 佛山 528051)

八寶驚風散為兒科經(jīng)典用藥,由鉤藤、防風、黃芩、沉香等19味中藥粉碎成細粉,過篩,混勻而成,具有退熱鎮(zhèn)驚、祛風化痰等功效[1-2],由于效果明顯,深受兒童消費者的青睞。八寶驚風散現(xiàn)行藥品執(zhí)行標準為衛(wèi)生部頒藥品標準(中藥成方制劑第20冊)WS3-B-3742-98,標準較簡單,只包括性狀項、茯苓、川貝母、黃芩、珍珠顯微鑒別、2項理化鑒別、丁香的薄層鑒別和檢查項,目前尚未有定量指標,這對其產(chǎn)品研究和臨床應用具有阻礙作用。由于處方成分復雜,八寶驚風散的質量控制手段有薄層鑒別、單組分氣相色譜法或液相色譜法[3-10]。經(jīng)文獻查閱,關于采用液質聯(lián)用法對八寶驚風散中單一或多種組分的含量檢測研究尚未報道。本實驗采用正離子掃描,多反應監(jiān)測模式,建立同時測定八寶驚風散中鉤藤活性成分異鉤藤堿、防風活性成分升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷,黃芩活性成分黃芩苷、沉香活性成分沉香四醇的LC-MS/MS檢測方法。以期為該中成藥的質量控制提供更全面、高效、可靠的分析方法,為其質量標準提高提供技術支撐。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Xevo-TQ 三重四級桿液質聯(lián)用儀(美國Waters);ELGA Q7純水超純水機(法國威立雅);XPR10微量天平(梅特勒-托利多);BS224S電子天平(德國Sartorius);S180/H超聲波清洗器(Elma);MS2迷你渦旋振蕩器(德國IKA);CT14RD 臺式高速冷凍離心機(上海天美)。

1.2 試劑

對照品升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號 111523-200405,含量100%)、黃芩苷、異鉤藤堿全部購自中國食品藥品檢定研究院。色譜純試劑:乙腈、甲醇、甲酸,水為實驗用超純水。藥品八寶驚風散(4家生產(chǎn)企業(yè)共10批次)均來源于市售。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1 對照品儲備液的制備

精密稱取異鉤藤堿約4mg、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷約10mg、沉香四醇、黃芩苷約20mg置于10mL量瓶中,加甲醇溶解并定容,配制含量范圍為0.40～2.0mg/mL的對照品單標儲備液。

2.1.2 混合對照品中間液的制備

準確移取上述對照品儲備溶液適量置同一量瓶(20 mL),用甲醇稀釋定容, 配制成含量范圍為2.0～10.0μg/mL的混合對照品中間液。

2.1.3 混合標準使用液的制備

精密移取混合對照品中間液適量,配制異鉤藤堿含量范圍約為0.01～0.20μg/mL,升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量范圍約為0.025～0.50μg/mL,沉香四醇、黃芩苷含量范圍約為0.05～1.0μg/mL的混合標準使用液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取八寶驚風散細粉約0.5g置于20mL量瓶中,加入適量甲醇,渦旋30s,放置超聲清洗器提取20min,放冷,甲醇定容,搖勻后轉移至10mL的離心管中,以12000 r/min離心 5 min,取適量上清液過0.22μm濾膜獲得供試品溶液,如樣品中部分成分濃度超出曲線線性范圍,可采用10%乙腈溶液稀釋,再進樣分析。

2.3 色譜與質譜條件

2.3.1 色譜條件

色譜柱 ACQUITY UPLC C18 柱(1.7μm,2.1mm×100 mm),流動相為0.1%甲酸溶液(A)-甲醇溶液(B),流速:0.30mL/min,柱溫:30℃, 進樣量:1μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.3.2 質譜條件

電噴霧離子源,離子源:150℃,正離子監(jiān)測,毛細管電壓3.6KV,多反應監(jiān)測,氬氣為碰撞氣,各成分質譜檢測參數(shù)見表2,標準圖譜見圖1。

圖1 標準TIC圖譜

表2 各成分質譜檢測參數(shù)

3 結果

3.1 標準曲線與線性試驗

取混合標準使用溶液各1μL,按“2.3” 項條件進行分析,以對照品峰面積Y對其濃度X進行回歸,結果見表3,結果表明各成分在各自質量濃度范圍內線性關系良好。按照樣品稱樣量0.20g,定容20mL,以3∶1信噪比為檢出限,以10∶1為定量限信噪比,計算各成分檢出限、定量限,結果見表3。

表3 各成分的線性回歸方程、相關系數(shù)等

3.2 精密度試驗

對某一混合標準使用溶液連續(xù)進樣 6次,測得升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、異鉤藤堿峰面積的RSD分別為3.0%、4.2%、3.0%、4.8%、2.0%,結果表明,儀器具有良好的精密度。

3.3 重復性試驗

稱取八寶驚風散(批號170302)適量共6份,按“2.2”項制備6份供試品溶液;按“2.3”項進樣測定,計算升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、異鉤藤堿的含量平均值分別為106.3mg/kg、640.2mg/kg、58.9mg/kg、2401.7mg/kg、2.15 mg/kg,RSD分別為4.2%、2.9%、3.7%、2.0%、4.8%,表明該法重復性較好。

3.4 穩(wěn)定性試驗

取“2.2”項供試品溶液(批號170302),分別于0h、1.0h、2.0h、4.0h、8.0h、12.0h、24.0h進行測定,結果升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、異鉤藤堿峰面積的RSD依次為4.1%、3.8%、3.2%、4.3%、3.5%,表明樣品溶液在24h內呈現(xiàn)良好穩(wěn)定性。

3.5 回收率實驗

精密稱取已知含量的八寶驚風散(170302)6份,每份稱量約0.5g,置于20mL量瓶中,加入各對照品儲備溶液,按“2.2”項制備待測液,進樣分析,計算回收率,結果見表4。

表4 各成分回收率和RSD(n=6)

3.6 方法應用

在本實驗條件下,按照“2.2”項對10批八寶驚風散藥品制備供試品溶液,按“2.3”項下色譜與質譜條件進行測定,外標法計算各成分的含量,其代表性圖譜見圖2,結果見表5。

圖2 樣品總離子流圖 批號170302

表5 八寶驚風散中各成分的含量測定結果(mg/kg)

4 討論

4.1 提取方法優(yōu)化

為確保八寶驚風散中各成分的有效提取與準確定量,本文考察了多種提取溶劑(50%甲醇溶液、甲醇、50%乙腈溶液、乙腈)對提取效率的影響,結果表明,采用純甲醇提取可獲得滿意結果。同時考察了不同的超聲提取時間(10 min、20 min、30 min)對提取效率的影響,發(fā)現(xiàn)超聲提取20 min能滿足檢測方法要求。

4.2 色譜條件的優(yōu)化

目前對于八寶驚風散的質量控制的研究主要為HPLC、UPLC等分析方法,各成分如需完全分離,洗脫時間較長,本研究運用特異性高的UPLC-MS/MS法,能顯著縮短樣品分析時間,試驗分別考察了甲醇和乙腈與揮發(fā)性緩沖液(0.1%甲酸水溶液、10 mmol乙酸銨溶液)組成的流動相體系對八寶驚風散中5種成分的離子化程度的影響。結果表明,當流動相體系為甲醇-0.1%甲酸時,各組分響應最高,峰型最優(yōu)。同時通過優(yōu)化此流動相體系的梯度洗脫程序,使5種成分在5min內獲得最佳分離。采用亞二微米小顆粒填料色譜柱能獲得較高靈敏度和分離度,本文分別對 BEH C8、C18色譜柱進行了考察,結果發(fā)現(xiàn),C18柱無論在峰型方面還是分離度方面,均優(yōu)于C8柱,因此,本實驗選擇C18色譜柱。

4.3 不同生產(chǎn)廠家樣品中5種成分的含量分析

從表5可知,該研究中5種組分在四家藥品生產(chǎn)企業(yè)均有檢出,但由于各企業(yè)藥材原料的生產(chǎn)產(chǎn)地和來源的差異,升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、異鉤藤堿的含量存在不同程度的差異。黃芩苷含量最高,含量范圍為1860.7～3740.2mg/kg,異構藤堿含量最低,含量范圍為0.82～7.89mg/kg,同時,5種成分在不同廠家,不同批號其其含量相差也較大。不同批號中異鉤藤堿的含量差異高達10倍,八寶驚風散處方中主藥包括鉤藤、防風。因此,八寶驚風散中異構藤堿、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量的差異將有效體現(xiàn)改藥品的質量。

建立同時測定八寶驚風散中升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、異鉤藤堿的液質檢測方法,該法靈敏度高,分析速度快,回收率好。LC/MS/MS法能有效排除樣品基質干擾,結果準確、可靠,可為八寶驚風散質量標準提高、藥效物質深入研究等提供技術參保障用藥安全。