石佳琦,梁國棟,王 娜,韓運祺,王玥璇,朱秋夢,呂 瑋,張 昕,肖云峰

(1.內蒙古醫(yī)科大學藥學院,內蒙古 呼和浩特 010110; 2.內蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司,內蒙古自治區(qū)蒙藥新藥研發(fā)企業(yè)重點實驗室,內蒙古 呼和浩特 010010; 3.內蒙古醫(yī)科大學新藥安全評價研究中心/內蒙古醫(yī)科大學藥學院,內蒙古 呼和浩特 010110)

沙棘作為藥食同源植物,具有很高的營養(yǎng)成分和藥用價值[1-2]。沙棘糖漿是根據蒙古醫(yī)書《飲膳正要》中赤哈納(即沙棘)的方劑,以《蒙藥正典》中的“沙棘祛痰,融化血,治巴達干病”為依據[3],將沙棘果實壓榨成汁,經提取、過濾、濃縮等一系列工藝后,再加入蔗糖漿進行稀釋,制成以沙棘汁為原料的糖漿劑。具有止咳化痰、消食化滯等作用。有文獻表明,沙棘糖漿可抑制小兒呼吸道感染,緩解咳嗽,改善兒童功能型消化不良,療效顯著[4-5]。本研究根據沙棘糖漿的功能主治,采用幼齡實驗動物為研究對象,進行了止咳祛痰、消食化滯方面的藥效學實驗研究,為其臨床應用提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SD大鼠,SPF 級,體質量(95±10)g;KM小鼠,SPF 級,體質量(15±2)g;英國(Hartley)豚鼠,SPF級,體質量(200±10)g。SD大鼠、KM小鼠購自斯貝福生物技術有限公司,動物生產許可證號:SCXK(京)2019-0010。英國(Hartley)豚鼠由北京市昌揚西山養(yǎng)殖場提供,動物生產許可證號:SCXK(京)2021-0008。飼養(yǎng)于內蒙古醫(yī)科大學動物實驗中心潔凈區(qū)。動物使用許可證編號:SYXK(蒙)2020-0001。

1.2 藥物與部分試劑

沙棘糖漿(內蒙古大唐,批號20825018)。小兒止咳糖漿(華潤三九,批號2001031N);四磨湯口服液(湖南漢森,批號2004311)。檸檬酸(優(yōu)晟環(huán)保,批號20200706);烏拉坦(上海康拓,批號20201110);碳酸氫鈉(海興旭陽,批號20191008);酚酞(沈陽金天源,批號20201116);中筋面粉(棗莊市內豐,批號20210326);現磨熟黃豆粉(哈爾濱寶利,批號20210423);大崎魚松粉(東山縣海弘,批號20210526);Mouse GAS、MTL、Pepsin、Trypsin、α-amylase Elisa kit(泉州市睿信,批號20210522001);高純食用葡萄糖粉劑(廣西梧州,批號20210502);淀粉(菱花集團,批號20200724);食用級活性炭末(鈺洋家具專營店,批號20200423)。

1.3 儀器

壓縮式霧化器(尚鈞醫(yī)療科技有限公司,型號 NB60);全自動酶標儀(美國Thermo Fisher,型號Multiskan MK3)。

1.4 主要試劑的配制

1.4.1 高熱量高蛋白飼料

將大崎魚松粉、現磨熟黃豆粉、中筋面粉、全脂高鈣奶粉按 1∶2∶1∶1 的比例混合,做成長條狀,陰干即得。

1.4.2 營養(yǎng)性半固體糊

取全脂高鈣奶粉18g、高純食用葡萄糖粉8g、淀粉8g和食用級活性炭末2g,稱定,置500mL燒杯中,加1%羧甲基纖維素鈉300mL攪拌均勻,即得。

1.5 沙棘糖漿對幼齡實驗動物止咳化痰的作用

1.5.1 沙棘糖漿對幼齡豚鼠止咳效果的影響

取120只豚鼠,采用枸櫞酸引咳法[6],將咳嗽次數n<5次和n>50次及潛伏期T<10 s和T>360 s的豚鼠剔除。次日將篩選出的合格的100只豚鼠,♀♂各半,隨機分為模型組、止咳糖漿組、沙棘糖漿低[1.45 g/kg(1.62 mL/kg)]、中[2.91 g/kg(3.23 mL/kg)]、高[5.82 g/kg(6.47 mL/kg)]劑量組5組。止咳糖漿組灌胃給予止咳糖漿5.6 mL/kg,空白組灌胃等體積飲用水,1次/d,給藥14 d。于末次給藥前禁食不禁水約8 h,末次給藥1 h后按預實驗方法進行試驗并記錄咳嗽潛伏期和5 min內咳嗽次數。

1.5.2 沙棘糖漿對幼齡大鼠痰液排放量的影響

取100只SD大鼠,♀♂各半,隨機分為模型組、止咳糖漿組、沙棘糖漿低[1.70 g/kg(1.89 mL/kg)]、中[3.40 g/kg(3.78 mL/kg)]、高[6.81 g/kg(7.56 mL/kg)]劑量組5組。灌胃給藥,止咳糖漿組灌胃給予止咳糖漿3.83 mL/kg,空白組灌胃等體積飲用水,1次/d,給藥14 d。參考文獻[7]進行實驗。

1.5.3 沙棘糖漿對幼齡小鼠氣管酚紅排泌量的影響

取KM小鼠120只,用氨水引咳法對小鼠進行篩選,選用3 min內發(fā)生咳嗽的小鼠作為實驗小鼠。選取合格小鼠100只,♀♂各半,隨機分為模型組、止咳糖漿組、沙棘糖漿低3.67 g/kg(4.09 mL/kg)、中7.36 g/kg(8.17 mL/kg)、高14.71 g/kg(16.35 mL/kg)劑量組5組。灌胃給藥。止咳糖漿組灌胃給予止咳糖漿5.20 mL/kg,空白組灌胃等體積生理鹽水,1次/d,給藥14 d。按照參考文獻[8]進行實驗。

1.6 沙棘糖漿對幼齡實驗動物消食化滯的作用

1.6.1 沙棘糖漿對幼齡動物消食效果的影響

取120只KM小鼠,♀♂各半。動物適應期喂養(yǎng)結束后,隨機分為6組,每組20只,空白組飼喂常規(guī)飼料,其余鼠飼喂自制的高熱量高蛋白飼料,2 d～7d,加喂0.2 mL/10g的牛奶溶液,2次/d。食積后小鼠精神不佳,活動量減弱,蜷縮扎堆,皮毛色變黃,食量減少,腹部腫脹,糞便呈棕黃色[9]。7 d后其余組別平均攝食量均低于空白組80 %,即造模成功。造模后的實驗動物隨機分為6組,♀♂各半,分別為空白組、模型組、四磨湯組(3.83mL/kg)、沙棘糖漿低[3.67g/kg(4.09mL/kg)]、中[7.36g/kg(8.17mL/kg)]、高[14.71g/kg(16.35mL/kg)]劑量組。模型組、空白組灌胃等體積生理鹽水。1次/d,給藥14 d。

代謝籠收集糞便,統計排便粒數,稱重糞便。

根據文獻[10]測定小鼠胃液 pH 值、胃液游離酸度、總酸、總酸排出量。

ELISA法檢測小鼠胃蛋白酶、α-淀粉酶、胰蛋白酶、胃泌素及胃動素水平。

1.6.2 沙棘糖漿對幼齡小鼠胃排空和小腸推進的影響

取100只KM小鼠,♀♂各半,隨機分為5組,分別為空白組、四磨湯組(3.83mL/kg)、沙棘糖漿低[3.67g/kg(4.09mL/kg)]、中[7.36g/kg(8.17mL/kg)]、高[14.71g/kg(16.35mL/kg)]劑量組?？瞻捉M灌胃給予動物飲用水10mL/kg。每天一次,連續(xù)給藥14 d。第13 d給藥后,禁食不禁水8h,于第14天灌胃給藥 40 min后,各組灌胃0.8 mL營養(yǎng)性半固體糊。20 min后頸椎脫臼處死小鼠,結扎賁門、幽門,取胃和小腸, 稱取全胃、凈胃質量[10]。按以下公式進行計算。

胃殘留(g)=全胃質量(g)-凈胃質(g)

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 沙棘糖漿對幼齡豚鼠止咳效果的影響

見表1。與空白組相比,沙棘糖漿高劑量組能顯著延長豚鼠的咳嗽潛伏期(P<0.01);中、高劑量組均能減少豚鼠5 min內的咳嗽次數(P<0.01、0.05)。

表1 沙棘糖漿對豚鼠止咳的作用

2.2 沙棘糖漿對幼齡大鼠痰液排放量的影響

見表2。與空白組相比較,沙棘糖漿高劑量組能顯著增加大鼠痰液排放量(P<0.01),與止咳糖漿組相比,沙棘糖漿高劑量組顯著增加大鼠痰液排放量(P<0.05)。

表2 沙棘糖漿對幼齡大鼠痰液排放量的影響

2.3 沙棘糖漿對幼齡小鼠化痰效果的影響

見表3。與空白組相比較,沙棘糖漿中、高劑量組均能顯著增加小鼠氣管酚紅排泌量(P<0.05、0.01),與止咳糖漿組相比,沙棘糖漿高劑量組顯著增加小鼠氣管酚紅排泌量(P<0.05)。

表3 沙棘糖漿對小鼠氣管酚紅排泌量的影響

2.4 沙棘糖漿對小鼠排便粒數和排便重量的影響

本試驗造模1周后小鼠行動緩慢,食欲下降,模型組平均攝食量比空白組下降29.3%,低于正常組20%以上,判定模型建立成功。沙棘糖漿對小鼠排便粒數和糞便重量的影響見表4。與空白組相比較,模型組小鼠排便粒數及排便重量均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,沙棘糖漿低、中、高劑量組能顯著增加小鼠的排便粒數(P<0.05、0.05、0.01);中、高劑量組能顯著增加小鼠的排便粒重量(P<0.05)。

表4 沙棘糖漿對各組小鼠排便粒數及排便重量的影響

2.5 沙棘糖漿對小鼠胃液 pH 值的影響

見表5。與空白組相比較,模型組小鼠胃液pH值升高(P<0.01)。與模型組相比較,沙棘糖漿高劑量組小鼠胃液pH值顯著降低(P<0.01)。

表5 沙棘糖漿對各組小鼠胃液pH值的影響

2.6 沙棘糖漿對小鼠游離酸,總酸,總酸排出量的影響

見表6。與空白組比較,模型組小鼠游離酸、總酸及總酸排出量均升高(P<0.05)。與模型組比較,沙棘糖漿各劑量組小鼠游離酸、總酸及總酸排出量均降低(P<0.01)。

表6 沙棘糖漿對各組小鼠游離酸、總酸及總酸排出量的影響

2.7 沙棘糖漿對小鼠胃功能[胃泌素(GAS)、胃動素(MTL)、胰蛋白酶(trypsin)、α-淀粉酶(α-amylase)、胃蛋白酶(Pepsin)]的影響

見表7。與空白組比較,模型組小鼠GAS濃度升高,MTL濃度、trypsin濃度(P<0.01)、α-amylase濃度(P<0.01)、Pepsin濃度降低。與模型組相比,沙棘糖漿低、中、高劑量組小鼠GAS濃度均降低(P<0.01);MTL濃度均升高,但無統計學差異(P>0.05);高劑量組小鼠trypsin濃度(P<0.01)、α-amylase濃度(P<0.05)、Pepsin濃度(P<0.01)升高。

2.8 沙棘糖漿對幼齡小鼠胃排空和小腸推進的影響

見表8。與空白組比較,沙棘糖漿高劑量組降低小鼠胃殘留、增強小腸推進率(P<0.01)。

表8 沙棘糖漿對小鼠胃排空及小腸推進作用

3 討論

沙棘糖漿是糖漿劑型道地蒙藥沙棘藥品,主治咳嗽痰多、食積腹痛[11]。研究表明,沙棘總黃酮通過阻斷ERK、PI3K/Akt和PKC信號通路,抑制IL-1β等因子誘導性高表達,從而發(fā)揮治療慢性支氣管炎的作用[12]。沙棘中還含有多種營養(yǎng)成份,促進胃酸合成,刺激胃液分泌,具有消食健胃的作用[13]。

在止咳化痰實驗中,通過幼齡小鼠氨水引咳,幼齡豚鼠枸櫞酸引咳,幼齡小鼠氣管酚紅排泌量,幼齡大鼠毛細管排痰量評價沙棘糖漿止咳、祛痰作用。研究結果表明,沙棘糖漿可以顯著改善檸檬酸引起豚鼠的咳嗽,增加大鼠痰液分泌量,有效促進小鼠體內酚紅排泌量,說明沙棘糖漿對幼齡動物具有一定的止咳化痰作用。

在消食化滯實驗中,通過建立食積癥動物模型,觀察幼齡小鼠胃殘留及小腸推進率,評價沙棘糖漿的對于消食化滯的作用。研究表明,與正常組相比較,給予沙棘糖漿處理后的小鼠胃排空率及小腸推進率明顯提高,說明沙棘糖漿可明顯改善小鼠胃腸動力功能。胃腸激素GAS、MTL、Trypsin、α-amylase、Pepsin與食積消化不良的發(fā)生密切相關。GAS促進胃酸分泌,加強胃腸道運動[14];MTL促進胃蛋白酶分泌,可加速腸胃蠕動及胃排空[15];Trypsin 抑制劑的分泌增加,會導致消化不良,生長停滯[16];α-amylase與胃腸道的消化代謝息息相關[17];Pepsi的活性會隨胃酸分泌增多而增強,從而誘發(fā)自身消化,造成胃黏膜損傷,促進潰瘍形成[18]。本研究結果表明,模型組小鼠GAS表達下調,Trypsin、、α-amylase、Pepsin表達上調,說明模型組小鼠出現明顯胃腸動力障礙。經沙棘糖漿處理后,消化不良的幼齡小鼠胃液恢復正常酸度,GAS表達上調,Trypsin、α-amylase、Pepsin表達下調,同時有改善幼齡小鼠便秘,但沙棘糖漿對MTL水平無明顯影響,說明沙棘糖漿可能通過促進GAS分泌,抑制Trypsin、α-amylase、Pepsin表達來改善小鼠胃腸功能,從而達到消食化滯的作用。

綜上所述,沙棘糖漿具有較好的安全性,本研究為沙棘糖漿的臨床兒童用藥及推廣提供了一定的參考依據。但仍存在一些不足:中藥方劑成分復雜,應進一步篩選有效成分進行研究;本研究參照咳嗽的生理病理特點進行動物模型的建立,但未能進行多種模型之間的結果比較,模型評價標準仍需統一;本次研究初步探討了沙棘糖漿干預前后GAS、MTL、Trypsin、α-amylase、Pepsin表達的變化,在機制方面的研究還有待進一步深入探討。