姜家錚 姚昆鵬 龍 云

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙 410007

冠心病不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina，UA）是我國常見心血管疾病，截至2020 年，我國累計冠心病患者1139 萬[1]，城鄉(xiāng)居民冠心病病死率分別為120.18/10 萬和128.24/10 萬[2]。UA 為冠狀動脈硬化、脂質(zhì)沉積長期發(fā)展的結(jié)果[3-4]，常具有不可逆性，西藥治療予以調(diào)脂穩(wěn)斑、抗血小板聚集、改善心肌血供、減輕心肌氧耗等[5]。然而，患者依從性差、經(jīng)濟負擔重等因素，在一定程度上限制了UA 的西醫(yī)治療。中醫(yī)藥治療UA 效優(yōu)價廉，無論依從性及經(jīng)濟角度，都具有較大優(yōu)勢。

桂枝生姜枳實湯系東漢張仲景于《金匱要略》中所載，“心中痞，諸逆，心懸痛，桂枝生姜枳實湯主之[6]”。此方溫陽化飲，下氣降逆，臨床多用于痰飲所致心胃陽氣不足之冠心病、心絞痛等[7]，然作用機制尚待進一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法將現(xiàn)有生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫與計算機技術(shù)結(jié)合，獲取實用的醫(yī)學(xué)信息[8-9]。通過明確上下游靶點來闡釋生物學(xué)過程，對于探索中醫(yī)遣方用藥規(guī)律具有重大作用，尤其適合中藥復(fù)方的研究[10-11]。2021 年世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會發(fā)布的《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價方法指南》[12]起到進一步的指導(dǎo)作用[13]。本研究擬使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討桂枝生姜枳實湯治療UA 的作用機制，以期為今后的體內(nèi)、外實驗及相關(guān)藥效學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 有效成分的篩選和作用靶點的預(yù)測

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索桂枝生姜枳實湯的藥物成分及作用靶點，條件設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，設(shè)置類藥性（drug likeness，DL）≥0.18，所得靶點通過UniProt 數(shù)據(jù)庫規(guī)范為標準化基因名。

1.2 獲取疾病相關(guān)靶點

以關(guān)鍵詞“unstable angina”在GeneCards、PharmGkb、DrugBank 數(shù)據(jù)庫中檢索UA 的疾病靶點。再設(shè)置篩選條件“Relevance Score ≥1”，將獲取的疾病靶點作進一步篩濾。

1.3 篩選藥物-疾病核心作用基因

通過Perl 軟件來比對以上藥物作用靶點與疾病靶點，獲得藥物-疾病核心作用基因。進而使用Cytoscape 3.8.0 軟件建立中藥成分-靶點的網(wǎng)絡(luò)圖譜。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)及拓撲分析

利用STRING 平臺建立交集靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)，獲得桂枝生姜枳實湯治療UA 的關(guān)鍵基因。再通過Cytoscape 3.8.0 軟件進行拓撲分析。

1.5 基因功能富集與通路富集分析

利用R 語言軟件對藥物-UA 疾病交集靶基因進行基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomics，KEGG）富集分析，涵蓋其生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF），找到差異最顯著的生物學(xué)通路，并將結(jié)果進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 有效成分篩選以及作用靶標預(yù)測

桂枝生姜枳實湯的藥物成分共檢索到34 種，其中桂枝7 種，生姜5 種，枳實22 種。經(jīng)靶標預(yù)測確定靶點139 個。

2.2 獲取UA的疾病靶點

檢索上述疾病數(shù)據(jù)庫并篩選去重后可得UA 疾病靶共899 個。將藥物靶點與疾病靶點比對，獲得77 個交集靶點。見圖1。

圖1 疾病靶點與藥物靶點交集Venn 圖

2.3 篩選藥物-疾病核心作用基因

基于Cytoscape 3.8.0 軟件平臺，將交集靶點進行整合，繪制“藥物-成分-靶點”圖，見圖2。共有相關(guān)靶點104 個，相互關(guān)系231 種。枳實中有效成分對應(yīng)靶點最多，其中木犀草素（luteolin）、柚皮素（naringenin）、川陳皮素（nobiletin）分別與35、23、23 個靶點相關(guān)。有效成分中對應(yīng)靶點數(shù)最多的是PTSG2 基因（24 個），其次PTGS1 基因（17 個）和HSP90AA1 基因（17 個）。

圖2 桂枝生姜枳實湯干預(yù)UA 的藥物-成分-靶點圖

2.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)與拓撲分析

將交集靶點導(dǎo)入STRING 平臺及Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)并可視化，見圖3，共計靶點63 個，相互關(guān)系185 種。利用CytoNCA 插件拓撲分析，共獲得核心基因6 個，按DC 排序為TP53、MAPK3、MAPK1、AKT1、ESR1、JUN，見圖4。

圖3 桂枝生姜枳實湯治療UA 主要靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 交集基因拓撲分析

2.5 GO/KEGG分析

將交集基因富集分析，得到GO 條目2085 個，其中BP 1917 個，CC 67 個，MF 101 個，選前10 建立柱狀圖（圖5A）；得到KEGG 通路152 條，選前30 建立氣泡圖（圖5B）。在GO 富集中發(fā)現(xiàn)活性氧代謝過程、氧化應(yīng)激反應(yīng)、膜筏+膜微結(jié)構(gòu)域、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性等生物過程在桂枝生姜枳實湯治療UA 過程中起到關(guān)鍵作用。在KEGG 富集分析中發(fā)現(xiàn)，與UA 相關(guān)的通路主要有PI3K-Akt、IL-17、HIF-1、p53 信號通路等。見圖5B。

圖5 桂枝生姜枳實湯潛在靶點的富集分析

3 討論

冠心病不穩(wěn)定型心絞痛為西醫(yī)病名，系冠狀動脈粥樣硬化致血管腔狹窄/痙攣，心臟供血供氧不足，進而心肌缺血的一類疾病。傳統(tǒng)中醫(yī)無此病名，根據(jù)其發(fā)病癥狀多歸為“胸痹心痛”。陽虛寒凝、血瘀痰濁被認為是UA 的主要證型[14]。張仲景在《金匱要略》有云：“夫脈當取太過不及，陽微陰弦，即胸痹而痛，所以然者，責(zé)其極虛也?！秉c明胸痹心痛病機為陽微陰弦，宜從溫陽立法。桂枝生姜枳實湯為溫陽法的代表，桂枝溫通心陽，生姜發(fā)越水氣，枳實除痞下氣，共奏通陽化飲，降逆理氣之功。

本研究發(fā)現(xiàn)，枳實中有效成分對應(yīng)靶點最多，其中木犀草素、柚皮素、川陳皮素可能是桂枝生姜枳實湯治療UA 的核心成分。木犀草素可抑制炎癥、抗氧化應(yīng)激，對冠心病、高血壓等多種心血管疾病具有防治作用，其機制與激活PI3K/Akt、TLR-4/NF-κB 信號通路，調(diào)節(jié)p53 等下游靶蛋白的表達密切相關(guān)[15]。此外，木犀草素可活化PI3K/Akt/mTOR 信號通路，改善心功能，抑制心室重構(gòu)[16]。線粒體功能障礙是心肌缺血再灌注（MI/R）誘導(dǎo)心肌細胞凋亡中的關(guān)鍵一環(huán)，改善線粒體損傷對治療UA 意義重大。柚皮素可直接抑制線粒體氧化應(yīng)激損傷并保持線粒體功能，從而減輕MI/R 損傷，AMPK-SIRT3 信號在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。川陳皮素具有抗血栓、抗血凝、抗炎、抗膽堿酯酶等作用[18]，可通過激活PI3K/Akt 信號通路，發(fā)揮抗心肌細胞損傷的作用，減少大鼠心肌細胞凋亡，在心血管領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景[19]。

目前對UA 的研究集中在降低血脂水平，改善缺氧所致的氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮損傷等。本研究GO 富集結(jié)果顯示，桂枝生姜枳實湯干預(yù)UA 主要通過兩方面，一為調(diào)節(jié)氧代謝，改善氧化應(yīng)激；二為調(diào)節(jié)細胞膜的通透性，促進轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。這與目前已知的UA 發(fā)病機制相對應(yīng)。KEGG 富集分析提示參與桂枝生姜枳實湯干預(yù)UA 的通路主要有PI3K-Akt、IL-17、HIF-1、p53 等，均為經(jīng)典的炎癥/氧化應(yīng)激/細胞凋亡相關(guān)通路，表明桂枝生姜枳實湯可能由此發(fā)揮抗心絞痛作用。

目前尚無關(guān)于桂枝生姜知枳實湯的有效成分、靶點和機制的報道。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，桂枝生姜枳實湯可能通過激活PI3K-Akt、IL-17、HIF-1、p53 等信號通路，調(diào)節(jié)TP53、MAPK3、MAPK1、AKT1、ESR1、JUN 等下游靶基因，改善缺氧所致心肌損傷，達到治療UA 的作用。然而本研究尚有一定的局限性，如數(shù)據(jù)庫收錄的數(shù)據(jù)有限，中藥成分研究尚不完整，以及缺乏相關(guān)體外細胞實驗支持等，因此需要進一步的實驗驗證。