付 靜，劉 清，于海葉，王 磊

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，新疆烏魯木齊 830011)

中國是食管癌發(fā)病率最高的國家，食管癌患者的5年總生存率通常低于20%，晚期食管癌患者的5年總生存率低于10%[1-2]，預(yù)后較差。環(huán)境和遺傳因素均可導(dǎo)致食管癌的發(fā)生。有特殊飲食和生活方式的人，如經(jīng)常食用腌制食品、熱食品，長期飲酒和大量吸煙，更容易患食管癌[3-4]；攜帶某些突變基因的人對腫瘤的易感性更高[5-6]。外科手術(shù)是食管癌的常用治療方法，但治療效果欠佳[7]，因此，尋求早期食管癌特異性的診斷和治療靶點具有重要意義[8-9]。

微小RNA(miRNA，miR)是一種能與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)結(jié)合的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，長度約為22 nt 且不編碼蛋白質(zhì)，其通過在轉(zhuǎn)錄后水平降解mRNA 或抑制翻譯來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[10]。miRNAs影響癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，包括增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞周期和凋亡，并在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用[11-13]。miR-495作為較常見的miRNA，在多種腫瘤中異常表達(dá)，在食管癌中miR-495 表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因的作用。目前，miR-495與其靶基因RNF113A在食管癌中的作用及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，本文將miR-495轉(zhuǎn)染入人食管鱗癌細(xì)胞Eca109，探討miR-495對食管鱗癌細(xì)胞惡性表型的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及試劑

人食管鱗癌細(xì)胞系Eca109購自武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心，DMEM(高糖)培養(yǎng)基、胰酶、青霉素-鏈霉素雙抗購于Gibco 公司，胎牛血清(FBS)購于Excell Bio公司，CCK-8 細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒和BCA 蛋白定量試劑盒購于全式金生物公司，miRNA 熒光定量PCR 試劑盒和蛋白預(yù)染Marker 購于上海生工公司，Lipofectamin RNAiMAX 購于Thermo Fisher 公司，TRIzolTMReagent 購于Ambion 公司，Transwell 小室購于Corning 公司，RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑購于博士德公司，β-actin Loading Control Antibody購于義翹神州，Anti-RNF113A購于Abcam公司。miR-495模擬物(miR-495 mimics) 和miR-49 抑制劑(miR-495 inhibitor)購于通用生物公司。

1.2 細(xì)胞分組處理

Eca109 采用DMEM 培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗溶液置于37 ℃、飽和濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合率達(dá)70%時使用Lipofectamin RNAiMAX試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分為模擬物對照組(mimics NC)、miR-495 模擬物組、抑制劑對照組、miR-495 抑制劑組，具體操作按照試劑說明書進(jìn)行。

1.3 實時熒光定量PCR 檢測細(xì)胞中miR-495 的表達(dá)水平

提取各組細(xì)胞中總RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行擴(kuò)增檢測miRNA 的表達(dá)，miR-495 以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算miR-495的相對表達(dá)量。

1.4 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖

將各組Eca109 細(xì)胞按照5×104個/mL 的濃度分別接種至96 孔板，每孔100 μL，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入100 μL濃度為10%的CCK-8 溶液，在培養(yǎng)箱中孵育1 h 后，采用酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處吸光度值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡

將Eca109 細(xì)胞調(diào)整為1×105個/mL 的單細(xì)胞懸液，接種至6 孔板中，每孔2 mL，然后胰酶消化細(xì)胞，PBS 沖洗，用預(yù)冷PBS 重懸細(xì)胞，將一部分細(xì)胞懸液加入到3.5 mL 預(yù)冷的80%乙醇中，4 ℃固定過夜，離心、沉淀細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS 洗滌，加入500 μL PI/RNase 染色緩沖液(staining buffer)重懸細(xì)胞并獲得單細(xì)胞懸液。4 ℃避光孵育30 min 后流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測細(xì)胞周期變化。另一部分細(xì)胞懸液，每管加入10 μL 的7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)和5 μL 膜聯(lián)蛋白V-PE(Annexin V-PE)，4 ℃避光孵育5 min，在30 min 內(nèi)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移與侵襲

將基質(zhì)膠稀釋后加入Transwell 小室的上層，37 ℃溫育5 h，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度為3×105個/mL，取100 μL 細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上層，將600 μL DMEM 完全培養(yǎng)基加入到Transwell下層，培養(yǎng)72 h，PBS沖洗，用4%甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色后于顯微鏡(×100)下隨機(jī)取5個視野統(tǒng)計細(xì)胞侵襲的數(shù)量。細(xì)胞遷移實驗無需預(yù)鋪基質(zhì)膠，將無血清細(xì)胞懸液接種到Transwell小室，其余步驟同上。

1.7 下游靶基因RNF113A mRNA 和蛋白表達(dá)的檢測

RNF113A 以β-actin 為內(nèi)參，采用qPCR 檢測RNF113A mRNA 的表達(dá)，方法同1.3。采用Western blot 檢測RNF113A 蛋白的表達(dá)。蛋白提取步驟：待培養(yǎng)皿中細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時，向細(xì)胞樣本加入200 μL RIPA 裂解液(已按1∶100 比例加入蛋白酶抑制劑和廣譜磷酸酶抑制劑)，充分混勻，4 ℃環(huán)境下設(shè)5 min 渦旋振蕩1 次，連續(xù)5 次后，以12000 r/min、4 ℃離心15 min 收集上清。加入1/3 體積的4×上樣緩沖液(loading buffer)，100 ℃金屬浴加熱處理10 min，使蛋白充分變性，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離提取的總蛋白，后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，在4 ℃的環(huán)境中一抗孵育過夜。抗體β-actin(1∶3000)和RNF113A(1∶1000)稀釋。TBST漂洗，加入稀釋后的二抗，山羊抗鼠IgG H&L(HRP)(1∶15000 稀釋)和山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶5000稀釋)室溫孵育1 h，TBST漂洗，采用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測、拍照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞中miR-495的表達(dá)水平

空白對照組、模擬物對照組、miR-495 模擬物組、抑制劑對照組和miR-495 抑制劑組細(xì)胞miR-495的相對表達(dá)水平分別為1.013±0.186、1.030±0.212、1.423±0.231、1.055±0.158和0.602±0.157。與模擬物對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-495模擬物組miR-495 mRNA水平顯著升高；與抑制劑對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-495抑制劑組miR-495 mRNA水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 各組細(xì)胞中miR-495的表達(dá)水平

2.2 miR-495對Eca109細(xì)胞增殖的影響

模擬物對照組、miR-495 模擬物組、抑制劑對照組和miR-495 抑制劑組培養(yǎng)48 h 后的D(450)值分別為0.871±0.046、0.831±0.050、0.866±0.060 和0.884±0.026，miR-495過表達(dá)或抑制劑干擾對食管癌Eca109細(xì)胞增殖均無顯著影響。各組細(xì)胞間增殖能力均無顯著變化(F=1.962，P=0.139)，見圖2。

圖2 miR-495對Eca109細(xì)胞增殖的影響

2.3 miR-495對Eca109細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響

模擬物對照組、miR-495 模擬物組、抑制劑對照組、miR-495 抑制劑組G0/G1 期細(xì)胞比例分別為(48.073±0.665)%、(56.280±0.563)%、(48.950±1.470)%和(50.413±0.437)%；S 期細(xì)胞比例分別為(25.850±1.296)% 、 (15.223 ± 0.754)% 、 (26.123 ± 2.456)% 和(31.150±1.532)%；細(xì)胞凋亡率分別為(3.300±0.854)%、(5.800±1.136)%、(3.433±0.577)%和(2.733±0.513)%，與模擬物對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-495 模擬物后G0/G1 期細(xì)胞顯著增多、S期減少、G2/M期增多、細(xì)胞凋亡顯著增多(P＜0.01)，說明miR-495 阻滯細(xì)胞分裂停留在G0/G1期；與抑制劑對照組相比，轉(zhuǎn)染抑制劑后S期顯著增多、G2/M期顯著減少。凋亡細(xì)胞顯著減少，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，說明抑制miR-495后細(xì)胞DNA合成活躍，大量細(xì)胞進(jìn)入S期，見圖3和圖4。

圖3 miR-495對Eca109細(xì)胞周期的影響

圖4 miR-495對Eca109細(xì)胞凋亡的影響

2.4 miR-495對Eca109細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

模擬物對照組、miR-495 模擬物組、抑制劑對照組和miR-495 抑制劑組細(xì)胞遷移數(shù)量分別為(95.3±6.3)、(63.8±5.2)、(96.9±4.9)和(104.9±5.3)個；侵襲數(shù)量分別為(93.6±6.4)、(63.7±6.1)、(94.3±5.8)和(105.8±7.1)個。與模擬物對照組比較，轉(zhuǎn)染模擬物后遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P＜0.01)；與抑制劑對照組相比，轉(zhuǎn)染抑制劑后遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增多，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖5和圖6。

圖5 miR-495對細(xì)胞遷移能力的影響

圖6 miR-495對細(xì)胞侵襲能力的影響

2.5 miR-495 對細(xì)胞中RNF113A mRNA 和蛋白表達(dá)的影響

模擬物對照組、miR-495模擬物組、抑制劑對照組和miR-495抑制劑組RNF113A mRNA相對表達(dá)水平分別為1.126±0.219、0.967±0.142、1.084±0.222和1.202±0.291；RNF113A 蛋白相對表達(dá)水平分別為0.600±0.010、0.380±0.050、0.700±0.010 和0.810±0.040。轉(zhuǎn)染miR-495模擬物和抑制劑后，RNF113A mRNA表達(dá)水平無明顯變化(F=0.833，P=0.520)；而轉(zhuǎn)染模擬物后，RNF113A 蛋白表達(dá)水平較對照組下降(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染抑制劑后RNF113A 蛋白表達(dá)水平較對照組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖7和圖8。

圖7 miR-495對細(xì)胞中RNF113A mRNA相對表達(dá)水平的影響

圖8 miR-495對細(xì)胞中RNF113A蛋白相對表達(dá)水平的影響

3 討論

miR-495 位于14 號染色體14q32.31 上[14]，參與實體腫瘤和血液腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和化學(xué)敏感性的變化[15]。已有研究證實miR-495 在多種惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)，包括非小細(xì)胞肺癌[16]、胰腺癌[17]、卵巢癌[18]、腎癌[[19]、胃癌[20]、肝細(xì)胞癌[21]、膽囊癌[22]。miR-495 作為抑癌基因或癌基因在不同類型的腫瘤中發(fā)揮不同的作用[23-24]。例如miR-495 在乳腺癌干細(xì)胞中高表達(dá)，可直接抑制E-cadherin 的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展[25]。而在大多數(shù)實體腫瘤中，miR-495 發(fā)揮抑癌基因的作用，例如miR-495可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲[26]；在胃癌組織中，miR-495 的表達(dá)與磷酸酶-3(PRL-3)的上調(diào)有關(guān)，PRL-3 是miR-495 的下游靶點，轉(zhuǎn)染miR-495 模擬物可抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[27]。本研究顯示miR-495 在食管鱗癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-495模擬物可抑制食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移，促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌基因的作用。

miR-495 在食管癌中的研究較少，在食管鱗癌進(jìn)展中的具體功能及分子機(jī)制仍不清楚。Mao 等[28]在食管鱗癌的研究中發(fā)現(xiàn)，與正常食管組織相比，miR-495 在食管鱗癌組織中表達(dá)水平降低，miR-495可通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及RACα 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase)信號通路影響細(xì)胞周期來抑制食管癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，同時miR-495的異常表達(dá)與食管癌患者的預(yù)后、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。miR-495通過靶向ATP酶銅轉(zhuǎn)運α(ATPase copper transporting alpha，ATP7A)基因抑制食管癌細(xì)胞的順鉑耐藥和血管生成[29-30]。

在本研究中，miR-495 過表達(dá)或抑制干擾對食管鱗癌Eca109 細(xì)胞增殖無顯著影響，Mao 等[28]的研究結(jié)果與此不同，他們通過集落形成實驗發(fā)現(xiàn)miR-495過表達(dá)可抑制Eca109和TE-1細(xì)胞系的增殖，因此miR-495 對食管癌細(xì)胞增殖的影響尚需進(jìn)一步驗證。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-495抑制了Eca109細(xì)胞遷移和侵襲能力，并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，相反抑制miR-495后促進(jìn)了細(xì)胞的侵襲和遷移能力，并抑制了細(xì)胞凋亡，改變了食管鱗癌細(xì)胞周期的分布。環(huán)指蛋白113A(ring finger protein 113A，RNF113A)作為RING 家族的一員，具有泛素連接酶功能，其主要位于Xq24-q25 號染色體上，可編碼一種蛋白質(zhì)，其中包含兩個與DNA烷基化修復(fù)和精子RNA拼接有關(guān)鋅指域[31]。RNF113A在結(jié)構(gòu)上具有特異性，主要依靠其結(jié)構(gòu)特征來發(fā)揮作用，其結(jié)構(gòu)主要由兩個鋅離子整合形成特征性的環(huán)形結(jié)構(gòu)，形似一把鉗子，可以鉗住相應(yīng)的靶蛋白，從而參與調(diào)解許多靶蛋白的周轉(zhuǎn)和活性[27]。miR-495 和很多環(huán)指蛋白密切相關(guān)，環(huán)指蛋白的結(jié)構(gòu)組具有高度的保守性，而RNF113A作為其中的一員，因此我們推測miR-495與RNF113A之間可能存在某種關(guān)系。為進(jìn)一步確認(rèn)miR-495 對RNF113A 的調(diào)控，我們進(jìn)行了qPCR 及Western blot 實驗，結(jié)果顯示與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-495 模擬物組RNF113A 蛋白表達(dá)水平下調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-495 抑制劑組RNF113A 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，但RNA水平未見顯著變化，說明miR-495可能通過轉(zhuǎn)錄后修飾以負(fù)向調(diào)控RNF113A蛋白的表達(dá)。既往研究顯示miR-495可與多種靶基因結(jié)合，通過調(diào)控靶基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如miR-495 作為腫瘤抑制因子，在非小細(xì)胞肺癌中被下調(diào)，腫瘤轉(zhuǎn)移基因3(MTA3)是公認(rèn)的非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素。miR-495 可以通過靶向MTA3 mRNA 降解影響非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移[32]。miR-495 在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)，miR-495通過調(diào)控膜聯(lián)蛋白A3基因抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[33]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-495通過靶向Akt1抑制細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換和EMT信號通路，從而抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[26]。本研究結(jié)果顯示，Eca109細(xì)胞過表達(dá)miR-495后，細(xì)胞凋亡增加，侵襲和遷移能力下降，與上述研究結(jié)果一致，但該研究未進(jìn)行miR-495 與RNF113A 關(guān)系的探討，本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-495可以負(fù)向調(diào)控RNF113A的蛋白表達(dá)，從而調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞惡性表型。

綜上，miR-495對Eca109細(xì)胞增殖能力無顯著影響，但可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制其遷移和侵襲能力，并調(diào)控細(xì)胞周期分布，同時miR-495 可通過抑制RNF113A 的蛋白表達(dá)調(diào)控Eca109 細(xì)胞惡性表型。本研究表明miR-495在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，有望成為食管鱗癌診斷及治療的新靶點。然而，由于靶基因調(diào)控具有多樣性，miRNA-495調(diào)控食管癌細(xì)胞惡性表型是否通過與其他靶基因的相互作用，還需要進(jìn)一步探索。