黃潔文，王艷慧，楊麗瑩，黃綺韻，吳舒楹，秦群英

（廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663）

化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’或柚Citrus grandis（L.）Osbeck 的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，具有理氣寬中、燥濕化痰的功效。道地化橘紅是《廣東省嶺南中藥材保護(hù)條例》立法保護(hù)的8種中藥材之首，有“南方人參”之稱(chēng)和“一片值一金”的說(shuō)法，因治痰有奇效成為明清時(shí)代的宮廷貢品，主產(chǎn)于廣東省化州市，產(chǎn)地根據(jù)藥材表面茸毛疏密、長(zhǎng)短，分為正毛、副毛、光果等不同類(lèi)別，業(yè)內(nèi)普遍認(rèn)為正毛化橘紅質(zhì)量最優(yōu)，副毛化橘紅次之，光果化橘紅再次之。茸毛疏密、長(zhǎng)短多根據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行鑒別，目前沒(méi)有具體的量化標(biāo)準(zhǔn)，具有較大主觀性，在外觀特征被破壞或不明顯的時(shí)候就更加難以判斷。

現(xiàn)有研究大多集中于比較化州柚和柚兩種不同基原化橘紅的質(zhì)量差異[1-8]，鮮有關(guān)于基原同為化州柚的正毛、副毛、光果化橘紅質(zhì)量差異的研究報(bào)道。本課題組在前期研究中試圖從主要藥效部位黃酮類(lèi)成分中尋找能夠區(qū)分不同類(lèi)別化橘紅的內(nèi)在質(zhì)量特征，發(fā)現(xiàn)正毛與副毛、光果之間有較明顯差異，但副毛與光果之間沒(méi)有明確界限，僅靠黃酮類(lèi)成分還難以將3個(gè)類(lèi)別化橘紅區(qū)分開(kāi)來(lái)。

揮發(fā)油是化橘紅主要藥效部位之一，現(xiàn)有研究主要采用GC 或GC-MS 法對(duì)化橘紅揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，研究化橘紅揮發(fā)性成分組成[9-10]，比較不同類(lèi)別[11-12]、不同產(chǎn)地[13]、不同采收時(shí)間[14]，以及化州柚花果葉等不同部位[15]的揮發(fā)性成分差異。常用的中藥材揮發(fā)性成分檢測(cè)的樣品前處理方法有水蒸汽蒸餾法和溶劑提取法，前者普遍存在重復(fù)性差、操作繁瑣耗時(shí)的問(wèn)題，而且樣品經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間蒸餾，揮發(fā)性成分的種類(lèi)和濃度可能會(huì)發(fā)生變化，不能準(zhǔn)確反映樣品原來(lái)的物質(zhì)組成，而后者則受提取溶劑性質(zhì)影響，也比較局限。頂空進(jìn)樣技術(shù)可實(shí)現(xiàn)樣品固態(tài)進(jìn)樣，通過(guò)加熱使揮發(fā)性組分從樣品中揮發(fā)出來(lái)，然后直接進(jìn)樣分析，該方法能夠簡(jiǎn)化樣品前處理，方法快速、重復(fù)性好，能夠相對(duì)準(zhǔn)確地反映樣品揮發(fā)性成分組成。

本研究首次采用頂空-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-GC/MS）對(duì)化橘紅藥材揮發(fā)性成分進(jìn)行研究，探索不同類(lèi)別化橘紅藥材的揮發(fā)性成分組成特點(diǎn)，對(duì)化橘紅質(zhì)量評(píng)價(jià)和等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)建立具有重要意義。

1 材料

1.1 樣品采集及處理

2020 年4 月至5 月在化州市化州中藥廠化橘紅GAP種植基地收集了36批化州柚鮮果樣品，其中正毛、副毛、光果各12批，經(jīng)廣州市香雪制藥股份有限公司王艷慧高級(jí)工程師鑒定均為蕓香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’。將化州柚鮮果置沸水中殺青2 min，取出瀝干水，除去果瓤和部分中果皮，于60 ℃烘干，即得化橘紅藥材樣品，備用。樣品信息見(jiàn)表1所示。

1.2 儀器

7890A-7000B型三重串聯(lián)四級(jí)桿氣質(zhì)色譜儀（美國(guó)Agilent公司，GC-QQQ Mass Hunter工作站）；TRI PLUS 300 頂空進(jìn)樣器（美國(guó)Thermo 公司）；MS204S型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；RHP-250 型高速粉碎機(jī)（浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司）。

1.3 試藥

檸檬烯對(duì)照品（批號(hào)100470-201503）、芳樟醇（批號(hào)111503-201603）、β-丁香烯（批號(hào)111819-201703）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；β-月桂烯對(duì)照品（批號(hào)BCBW0611）、γ-松油烯（批號(hào)BCBZ1985）、α-松油烯（批號(hào)BCBW4489）、間傘花烴（批號(hào)BCBT7572）均購(gòu)自美國(guó)Sigama 公司；α-蒎烯（批號(hào)G1809164）、β-蒎烯（批號(hào)F1912161）均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2 方法

2.1 HS-GC/MS條件

頂空進(jìn)樣條件：頂空樣品平衡溫度95 ℃，平衡時(shí)間40 min，定量環(huán)溫度105 ℃，傳輸管溫度115 ℃，中速振搖，進(jìn)樣體積1 mL。

GC條件：色譜柱Agilent HP-INNOWAX（30 m×250 μm×0.15 μm）；柱溫為程序升溫：初始溫度35 ℃，保持3 min；以5 ℃/min 的速率升溫至80 ℃；再以20 ℃/min 的速率升溫至100 ℃；再以5 ℃/min的速率升溫至160 ℃；最后以20 ℃/min 的速率升溫至240 ℃。進(jìn)樣口溫度115 ℃；分流比300∶1；載氣：高純氦氣（純度＞99.999%）；流速0.6 mL/min。

MS 條件：電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲3 min；全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z20～350。

2.2 供試品制備

化橘紅藥材樣品粉碎，過(guò)二號(hào)篩，取粉末0.50 g，精密稱(chēng)定，置20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，即刻加蓋密封，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取編號(hào)S6 化橘紅樣品粉末，按“2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品，按“2.1”項(xiàng)下分析條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄各共有峰的保留時(shí)間及峰面積。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.08%，相對(duì)峰面積RSD＜1.64%。表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)S6 化橘紅樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品，按“2.1”項(xiàng)下分析條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄各共有峰的保留時(shí)間及峰面積。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.06%，相對(duì)峰面積RSD＜2.57%。表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)S6 化橘紅樣品粉末，按“2.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品，分別在0、6、12、18、24、48 h 進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下分析條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄各共有峰的保留時(shí)間及峰面積。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.05%，相對(duì)峰面積RSD＜2.26%。表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)行2012版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（下簡(jiǎn)稱(chēng)《相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》）對(duì)采集到的樣品HS-GC/MS 總離子流圖進(jìn)行指紋圖譜分析；利用NIST08.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)主要共有峰進(jìn)行化合物檢索；采用SPSS（25.0版本）作進(jìn)一步數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；利用Origin 2019b輔助繪圖。

3 結(jié)果

3.1 化橘紅HS-GC/MS 對(duì)照指紋圖譜建立及樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

將36 批化橘紅樣品HS-GC/MS 總離子流圖（圖1）導(dǎo)入《相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》，通過(guò)“生成對(duì)照”模式，時(shí)間窗口設(shè)定為0.1 min，以平均數(shù)法生成化橘紅HS-GC/MS 對(duì)照指紋圖譜（圖2），共標(biāo)定11 個(gè)共有峰（峰編號(hào)1－11），各批次樣品的共有峰峰面積總和占總峰面積的94.78%～99.27%，其中峰5（檸檬烯）響應(yīng)值最高且出峰時(shí)間穩(wěn)定，因此設(shè)為參比峰（S 峰）。利用《相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》分別計(jì)算各批樣品HS-GC/MS指紋圖譜與化橘紅HS-GC/MS對(duì)照指紋圖譜的相似度，結(jié)果顯示不同類(lèi)別化橘紅樣品的相似度不低于0.896（見(jiàn)表2），表明不同類(lèi)別化橘紅樣品的揮發(fā)性成分具有相似性。

圖1 36批化橘紅樣品HS-GC/MS指紋圖譜Figure 1 HS-GC/MS fingerprint of Citri Grandis Exocarpium from 36 samples

圖2 化橘紅HS-GC/MS對(duì)照指紋圖譜Figure 2 HS-GC/MS reference fingerprint of Citri Grandis Exocarpium

表2 36批化橘紅HS-GC/MS指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Similarity of Citri Grandis Exocarpium from 36 samples

進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)正毛、副毛、光果化橘紅的HSGC/MS 指紋圖譜也存在一些差異，為評(píng)價(jià)各類(lèi)別化橘紅揮發(fā)性成分HS-GC/MS 指紋圖譜差異性，進(jìn)一步利用《相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》分別生成正毛化橘紅HSGC/MS 對(duì)照指紋圖譜（圖3）、副毛化橘紅HS-GC/MS 對(duì)照指紋圖譜（圖4）、光果化橘紅HS-GC/MS 對(duì)照指紋圖譜（圖5），除以上11個(gè)共有峰外，正毛化橘紅另有共有峰14 個(gè)（Z1－Z14），副毛化橘紅另有共有峰3 個(gè)（F1－F3），光果化橘紅另有共有峰1 個(gè)（G1）。利用《相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》分別計(jì)算各批樣品HS-GC/MS指紋圖譜與各類(lèi)別化橘紅HS-GC/MS對(duì)照指紋圖譜的相似度，以相似度最高者作為判定類(lèi)別，結(jié)果顯示判定類(lèi)別與實(shí)際化橘紅藥材類(lèi)別一致，利用不同類(lèi)別指紋圖譜相似度判定化橘紅藥材類(lèi)別成功率達(dá)100%（表2）。

圖3 正毛化橘紅HS-GC/MS對(duì)照指紋圖譜Figure 3 HS-GC/MS reference fingerprint of Citri Grandis Exocarpium(Zhenmao)

圖4 副毛化橘紅HS-GC/MS對(duì)照指紋圖譜Figure 4 HS-GC/MS reference fingerprint of Citri Grandis Exocarpium(Fumao)

圖5 光果化橘紅HS-GC/MS對(duì)照指紋圖譜Figure 5 HS-GC/MS reference fingerprint of Citri Grandis Exocarpium(Guangguo)

利用NIST08.L 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述共有峰可能所屬成分進(jìn)行檢索，并通過(guò)對(duì)照品比對(duì)，進(jìn)一步確認(rèn)其中1、2、4、Z3、5、7、Z4、8、9 號(hào)峰分別為α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-松油烯、檸檬烯、γ-松油烯、間傘花烴、芳樟醇、β-丁香烯，具體見(jiàn)表3。

表3 化橘紅對(duì)照指紋圖譜共有峰信息Table 3 common peak information of reference fingerprint of Citri Grandis Exocarpium

3.2 化橘紅HS-GC/MS指紋圖譜聚類(lèi)分析

將36 批化橘紅樣品HS-GC/MS 指紋圖譜的11個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS（25.0版本），采用組間連接法（Between-groups linkage），以平方歐式距離（Squared Euclidean distance）為測(cè)度進(jìn)行聚類(lèi)分析。從聚類(lèi)譜系圖（圖6）可見(jiàn)，在距離軸為5 時(shí)，36 批樣品聚為9支，其中12批正毛化橘紅聚為2支，12批光果化橘紅聚為2支，但其中1支中混進(jìn)了1批副毛化橘紅，而另外11 批副毛化橘紅則聚為5 支；在距離軸為10 時(shí)，36 批樣品進(jìn)一步聚為5 支，而聚類(lèi)情況開(kāi)始變得混雜，其中1支包含了正毛化橘紅、副毛化橘紅和光果化橘紅，1 支包含副毛化橘紅和光果化橘紅，1 支為正毛化橘紅，另有2 支為副毛化橘紅。結(jié)果未能將3 個(gè)類(lèi)別化橘紅分別聚類(lèi)，表明各類(lèi)別化橘紅組內(nèi)具有一定離散性，尤其是副毛化橘紅組內(nèi)離散性相對(duì)較大。

圖6 化橘紅HS-GC/MS指紋圖譜共有峰聚類(lèi)分析Figure 6 Cluster analysis of common peaks in HS-GC/MS fingerprint of Citri Grandis Exocarpium

3.3 不同類(lèi)別化橘紅主要揮發(fā)性成分特征研究

對(duì)比不同類(lèi)別化橘紅HS-GC/MS 對(duì)照指紋圖譜可見(jiàn)，其中的主要成分β-月桂烯（峰4）、檸檬烯（峰5）、γ-松油烯（峰7）的分布有明顯差異特征。進(jìn)一步采用Origin 2019b 軟件對(duì)這3 個(gè)成分的峰面積比值作繪圖分析，以β-月桂烯/檸檬烯、γ-松油烯/檸檬烯、β-月桂烯/γ-松油烯作圖，結(jié)果顯示3 個(gè)不同類(lèi)別化橘紅明顯分開(kāi)（圖7）。正毛化橘紅的γ-松油烯/檸檬烯峰面積比值（0.419 1～0.781 8）顯著高于副毛（0.001 7～0.026 4）和光果化橘紅（0.006 1～0.062 5）；副毛化橘紅的β-月桂烯/γ-松油烯峰面積比值（17.896 7～145.256 3）則顯著高于正毛（0.256 0～0.509 6）和光果化橘紅（0.505 4～6.654 3）。

圖7 不同類(lèi)別化橘紅主要揮發(fā)性成分的特征Figure 7 Characteristics of main volatile components in different kinds of Citri Grandis Exocarpium

4 討論

本研究首次建立了化橘紅揮發(fā)性成分HS-GC/MS 指紋圖譜分析方法，方法重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性良好，操作簡(jiǎn)便，且檢測(cè)過(guò)程無(wú)須使用化學(xué)試劑，具有綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。在研究建立HS-GC/MS 分析方法過(guò)程中，對(duì)樣品取樣量、頂空樣品平衡溫度和時(shí)間、振搖速度，以及色譜柱類(lèi)型、進(jìn)樣分離比、柱溫升溫程序等因素進(jìn)行了考察。研究發(fā)現(xiàn)頂空樣品平衡溫度對(duì)檢測(cè)影響較大，平衡溫度過(guò)低，檢出峰數(shù)量少且響應(yīng)低，平衡溫度超過(guò)一定度數(shù)后，則出峰數(shù)量與峰響應(yīng)變化不明顯，且溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致樣品外觀顏色變深并伴有焦糊味，可能影響檢測(cè)，綜合考慮樣品出峰數(shù)量、峰響應(yīng)，且盡可能保持樣品外觀、氣味接近原始狀態(tài)，最終優(yōu)選頂空進(jìn)樣平衡溫度為95 ℃。

道地化橘紅的基原為化州柚，傳統(tǒng)上化州柚果實(shí)重要的性狀特征是外果皮密被茸毛，但受品種培育、種植養(yǎng)護(hù)、氣候等因素綜合影響，目前化州柚茸毛特征有了不同的狀態(tài)，化州地區(qū)所產(chǎn)的化橘紅有的還保持密被茸毛，有的茸毛密但短小，有的茸毛稀疏或不均勻。產(chǎn)地一般根據(jù)外果皮茸毛疏密、長(zhǎng)短，分為正毛化橘紅、副毛化橘紅、光果化橘紅等3個(gè)類(lèi)別。本研究結(jié)果表明，不同類(lèi)別化橘紅的揮發(fā)性成分有相似性，但也存在較明顯差異特征，正毛化橘紅揮發(fā)性成分種類(lèi)比副毛化橘紅、光果化橘紅更加豐富。通過(guò)構(gòu)建各類(lèi)別化橘紅藥材各自的HS-GC/MS 對(duì)照指紋圖譜，然后分別計(jì)算樣品與各類(lèi)別對(duì)照的相似度，以相似度最高者判別藥材類(lèi)別歸屬，成功率可達(dá)100%。進(jìn)一步對(duì)比各類(lèi)別化橘紅HS-GC/MS 指紋圖譜中β-月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯3 個(gè)主要成分的峰面積發(fā)現(xiàn)，正毛化橘紅中這3個(gè)成分的峰面積都較高，副毛化橘紅中β-月桂烯和檸檬烯峰面積較高、γ-松油烯峰面積較低，而光果化橘紅中檸檬烯峰面積較高、β-月桂烯和γ-松油烯峰面積較低，因此，通過(guò)這3個(gè)揮發(fā)性特征性成分的相對(duì)峰面積比值，尤其是γ-松油烯與檸檬烯峰面積比值，結(jié)合β-月桂烯與γ-松油烯峰面積比值，可以判斷化橘紅藥材類(lèi)別。雖然傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別可以根據(jù)茸毛疏密、長(zhǎng)短對(duì)化橘紅類(lèi)別作出快速鑒別，但當(dāng)藥材外觀特征被破壞或不明顯時(shí)，傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別方法就未必適用，若在傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代儀器分析方法，將有助于對(duì)藥材質(zhì)量作出更加準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。本研究所建立的化橘紅HS-GC/MS 對(duì)照指紋圖譜和篩選的化橘紅揮發(fā)性特征成分相對(duì)峰面積范圍能有效判別不同類(lèi)別化橘紅，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可以為化橘紅質(zhì)量評(píng)價(jià)和規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)建立提供重要方法參考和數(shù)據(jù)支持。通過(guò)對(duì)化橘紅揮發(fā)性成分HS-GC/MS 指紋圖譜研究，發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)別化橘紅中β-月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯的分布存在明顯差異特征，這種差異特征是否與其質(zhì)量等級(jí)和藥效優(yōu)劣相關(guān)，值得后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

不同類(lèi)別化橘紅聚類(lèi)分析結(jié)果與β-月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯相對(duì)峰面積比值分析結(jié)果均顯示副毛化橘紅揮發(fā)性成分的組內(nèi)離散度相對(duì)較大。根據(jù)作者實(shí)地調(diào)研了解，這可能與化橘紅品種培育，尤其是砧木、嫁接母本的選擇有很大關(guān)系，目前化橘紅栽培品種眾多，加上受環(huán)境、種植、養(yǎng)護(hù)、加工等各種因素綜合影響，使得化橘紅藥材質(zhì)量參差不齊。因此，亟需建立化橘紅種苗鑒定、培育、種植養(yǎng)護(hù)等系列技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，鼓勵(lì)優(yōu)質(zhì)正毛化橘紅品種種植，促進(jìn)道地化橘紅產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。

考慮到影響藥材內(nèi)在質(zhì)量的因素較多，本研究選擇在同一基地采集代表性栽培品種的化州柚鮮果，并采用統(tǒng)一加工方法制作成化橘紅樣品作為研究對(duì)象，盡量避免因環(huán)境、種植、養(yǎng)護(hù)、藥材加工等其他因素不同而造成的差異，探索了不同類(lèi)別化橘紅藥材的揮發(fā)性成分特征，未來(lái)仍需要擴(kuò)大樣本范圍，以驗(yàn)證本研究結(jié)果，并且需要根據(jù)后續(xù)研究情況，不斷修正完善限度范圍，以便具有更高普適性。