宋春林 張雨晴 翟玉靜 張剛 王穎

(青島大學(xué),山東 青島 266071 1 腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院; 2 公共衛(wèi)生學(xué)院)

通過引入突變進(jìn)行基因功能的研究是常用的實(shí)驗(yàn)方法,基因突變可以發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外。目前,鑒定突變體的通用方法是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)的基因組DNA片段,然后進(jìn)行DNA測序以確定突變是否成功,實(shí)際操作成本高且耗時長[1］。使用傳統(tǒng)方法在基因組上實(shí)現(xiàn)基因突變的難度很高,近年來CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因編輯中的成功應(yīng)用為實(shí)現(xiàn)基因突變提供了更快捷精準(zhǔn)的手段[2-5］。然而,CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)突變的效率受到多種因素影響,包括細(xì)胞類型、基因拷貝數(shù)、突變類型以及基因組位點(diǎn)等[6-8］,科研成本相對較高。

為了解決基因定點(diǎn)突變的鑒定問題,本研究旨在構(gòu)建一種使用突變引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的突變體篩選方法,即在引物3′端的1～3個堿基處引入與突變序列相匹配的核苷酸,分別檢驗(yàn)它們對細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)突變的檢測效率。相較于傳統(tǒng)的測序方法,該方法可快速高效地檢測正確的體外定點(diǎn)突變體或CRISPR/Cas9介導(dǎo)的敲入突變體,可簡化實(shí)驗(yàn)步驟,達(dá)到有效提高篩選效率和節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本的目的。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

HCT116和LN299細(xì)胞購自中國科學(xué)院蘇州生物研究創(chuàng)新中心;DH5α大腸桿菌細(xì)胞購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;胎牛血清購自美國BI公司;胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Ther-mo Fisher Scientific公司;單鏈寡核苷酸(ssODN)購自美國IDT公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

DH5α大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)于含50 mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HCT116和LN299細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.1的胎牛血清和含有抗生素(青霉素10 kU/L,鏈霉素0.01 g/L)的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 體外定點(diǎn)突變體的構(gòu)建

使用含有突變位點(diǎn)的引物對于包含有目標(biāo)基因的質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR。PCR反應(yīng)的總體積為25 μL:0.5 μL模板(質(zhì)量濃度5×10-5g/L),1 μL引物(每條,摩爾濃度為10 μmol/L),2 μL dNTPs, 1.5 μL MgSO4,2.5 μL 10×PCR Buffer,0.5 μL KOD-Plus-Neo(TOYOBO,日本)和16 μL ddH2O。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;然后98 ℃變性15 s,51 ℃退火30 s,68 ℃延伸4 min,共進(jìn)行34個循環(huán);最后68 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后加入1 μL DpnI,37 ℃孵育1 h以消化PCR反應(yīng)體系中的質(zhì)粒模板,后將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α涂平板后,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)至形成單菌落,次日挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR,鑒定正確突變體。本研究所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成,引物序列見表1。

1.4 體外定點(diǎn)突變體的篩選

菌落PCR反應(yīng)的總體積為7 μL:1 μL引物(每條,濃度為10 μmol/L),3.5 μL的2×Taq Plus Master Mix II(Vazyme,中國)和1.5 μL的ddH2O。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;然后 94 ℃變性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共進(jìn)行34個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有DNA擴(kuò)增條帶。引物序列見表1。

1.5 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的敲入突變體的構(gòu)建

以PX459為載體構(gòu)建靶向c-Jun外顯子1的質(zhì)粒。以單鏈寡核苷酸為模板DNA,在基因組中引入P244A突變。首先將飽和度40%的HCT116細(xì)胞接種于6孔板上;次日將PX459和模板DNA各2 μg加入到Lipofectamine 2000中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染;24 h后加入1 mg/L嘌呤霉素進(jìn)行篩選,篩選48 h后用普通DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至形成單克隆,以備用于后續(xù)基因組DNA提取。同樣的方法也應(yīng)用于LN299細(xì)胞HDAC1的Y87F突變。

1.6 基因組DNA的提取

收集約100 000個LN299或者HCT116細(xì)胞,PBS緩沖液洗滌以后重懸于150 μL的5 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)中,95 ℃孵育10 min。細(xì)胞裂解液冷卻至室溫后,加入30 μg蛋白酶K,56 ℃孵育30 min以后,95 ℃孵育10 min。以13 000 r/min離心2 min,將含有基因組DNA的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中,于-20 ℃保存,以備用于后續(xù)的基因組PCR鑒定。

1.7 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的敲入突變體的篩選

以200 ng HCT116或LN299基因組DNA為模板,使用3′端最后1、2或3個核苷酸與突變序列相匹配的篩選引物(HDAC1-1、HDAC1-2、HDAC1-3)進(jìn)行基因組PCR。反應(yīng)體系為12 μL:2 μL模板,1 μL引物(每條,濃度為10 μmol/L),6 μL的2×Taq Plus Master Mix II和2 μL的ddH2O。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;然后94 ℃變性30 s,64 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共進(jìn)行34個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min?；蚪MPCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有擴(kuò)增條帶。其后通過提高退火溫度和在引物的3′端引入新突變的方法進(jìn)一步優(yōu)化HDAC1-1引物的檢測特異性。引物序列見表1。

1.8 DNA測序

按照1.6中的方法提取HCT116或LN299細(xì)胞基因組DNA,使用位于預(yù)期敲入位點(diǎn)的上游和下游約200 bp處的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。引物序列見表1。

1.9 不同DNA聚合酶擴(kuò)增效率的檢驗(yàn)

分別使用普通Taq酶2×Hieff?PCR Master Mix with dye(YEASEN公司,中國)、2×Taq Plus Master Mix II dye plus(Vazyme公司,中國),高保真DNA聚合酶2×Hieff Canace?Plus PCR Master Mix with dye(YEASEN公司,中國)、2×Phanta Flash Master Mix dye plus(Vazyme公司,中國)、KOD OneTM PCR Master Mix(TOYOBO公司,日本)對突變體進(jìn)行PCR檢測,通過比較擴(kuò)增條帶的強(qiáng)度確定不同DNA聚合酶的擴(kuò)增效率。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞外突變的檢測結(jié)果

使用3′端包含突變基因序列的正向引物和下游DNA序列的反向引物,分別檢測了構(gòu)建在pcDNA5/FRT/To載體上3個基因的定點(diǎn)突變。第一個是VRK1基因發(fā)生了抗RNA干擾突變:分別以正確突變基因和未成功突變基因的菌落為模板,使用3′端與第1個突變位點(diǎn)(A→G)匹配的正向引物(5′-CATGGCAAAAAAGGAG-3′)和下游DNA序列的反向引物進(jìn)行菌落PCR反應(yīng),正確突變基因的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳顯示有大小約為1 100 bp的強(qiáng)DNA擴(kuò)增條帶,未成功突變基因則沒有擴(kuò)增條帶(圖1A、B);第2個是BubR1基因發(fā)生L669A/I672A突變:分別以正確突變基因以及未成功突變基因的菌落為模板,使用3′端與突變位點(diǎn)(CT→GC)匹配的正向引物(5′-TCAGCATCAAGAAGGC-3′)和下游DNA序列的反向引物進(jìn)行菌落PCR反應(yīng),正確突變基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,顯示有大小約1 300 bp的強(qiáng)信號條帶,未成功突變基因則沒有擴(kuò)增條帶(圖1C、D);第3個是Cdc20基因發(fā)生C165E突變:分別以正確突變基因和未成功突變基因的菌落為模板,使用3′端與突變位點(diǎn)(TGT→GAA)匹配的正向引物(5′-CAGCCGCAAAACGGAA-3′)和下游DNA序列的反向引物進(jìn)行菌落PCR反應(yīng),正確突變基因的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,顯示有大小約1 000 bp的強(qiáng)信號條帶,未成功突變基因則沒有擴(kuò)增條帶(圖1E、F)。

2.2 細(xì)胞內(nèi)突變的檢測結(jié)果

當(dāng)使用只有一個核苷酸匹配突變序列的引物HDAC1-1時,親本基因組擴(kuò)增得到弱信號條帶,同時敲入基因組擴(kuò)增出強(qiáng)信號條帶;使用HDAC1-2、HDAC1-3時,只有敲入突變基因組產(chǎn)生強(qiáng)信號的條帶,親本基因組無擴(kuò)增(圖2A、B)。進(jìn)一步優(yōu)化HDAC1-1引物的檢測特異性發(fā)現(xiàn),升高退火溫度,敲入突變基因組與親本基因組條帶的強(qiáng)度比不斷增加,當(dāng)退火溫度設(shè)置為70 ℃時,兩者的擴(kuò)增均告失敗(圖2C)。

進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)顯示,在只有1個核苷酸與突變序列匹配的引物的3′端倒數(shù)第2、3和4位分別引入新的突變,也能夠提高反應(yīng)的特異性(圖3)。

最后,采用該方法成功地篩選出在HCT116細(xì)胞的c-Jun基因上發(fā)生P244A(CCC→GCT)敲入突變成功的克隆(圖4A、B)。

A:HDAC1野生型(頂部)與突變型(底部)的序列比對;B:野生型HDAC1的親本細(xì)胞基因組(第1、3、5泳道)和HDAC1 Y87F敲入突變細(xì)胞基因組(第2、4、6泳道)PCR結(jié)果,1與2,3與4、5與6泳道的反應(yīng)分別使用HDAC1-1、HDAC1-2、HDAC1-3引物;C:優(yōu)化HDAC1-1引物的退火溫度的結(jié)果,第1、3、5、7、9和11泳道為野生型HDAC1,第2、4、6、8、10和12泳道為突變型HDAC1

野生型HDAC1的親本細(xì)胞基因組(第1、3、5、7、9泳道)和HDAC1 Y87F敲入突變基因組(第2、4、6、8、10泳道)的PCR擴(kuò)增結(jié)果;1與2、3與4、5與6、7與8、9與10泳道分別使用HDAC1-1,HDAC1-1-2、HDAC1-1-3、HDAC1-1-4和HDAC1-1-5(倒數(shù)第5位引入新突變)引物

A:野生型(頂部)與突變型c-Jun(底部)的DNA序列比對;B:使用3′端含有4個突變核苷酸的反向引物,對32個細(xì)胞株(1～32泳道)進(jìn)行基因組PCR,33～35泳道分別為親本細(xì)胞、敲入后的混合細(xì)胞和c-Jun陽性對照的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 不同DNA聚合酶檢測效率的比較

為提高該方法的擴(kuò)增效率,本研究比較了5種不同DNA聚合酶對于突變體檢測的效率,結(jié)果表明普通的Taq酶較高保真DNA聚合酶,更適用于突變克隆的篩選(圖5)。

3 討 論

DNA突變是研究基因功能的常用方法,但通過DNA測序找到正確的突變體往往需要耗費(fèi)大量時間和金錢,尤其是在突變成功率偏低的情況下。隨著CRISPR/Cas9介導(dǎo)的敲入突變方法越來越廣泛地應(yīng)用,這個問題變得越來越突出。因此,設(shè)計新的方法以提高突變克隆鑒定效率具有極高的應(yīng)用價值。例如,可以在引入目的突變的同時引入限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn),從而間接識別陽性克隆。然而,大多數(shù)基因無法在引入限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的同時保持所編碼的氨基酸不變,從而極大地限制了該方法的應(yīng)用。

泳道1、3、5、7、9使用HCT116 c-Jun野生型細(xì)胞基因組DNA為模板,泳道2、4、6、8、10為HCT116 c-Jun P244A敲入突變細(xì)胞基因組DNA為模板;第1、2和9、10泳道使用YEASEN和Vazyme的普通Taq酶,第3～8泳道分別使用YEASEN、Vazyme和TOYOBO的高保真DNA聚合酶

本研究借鑒了疾病診斷中常用的基于PCR反應(yīng)的突變檢測方法,并進(jìn)行了針對性的優(yōu)化,來快速篩選帶有目的突變的陽性克隆。本研究中首先使用克隆在質(zhì)粒上的含有定點(diǎn)突變的VRK1、BubR1和Cdc20基因來檢測該方法能否有效鑒定細(xì)胞外突變。VRK1參與包括細(xì)胞周期的起始、G2/M期的染色質(zhì)濃縮、高爾基體斷裂和有絲分裂中的核膜組裝等多個過程,多種腫瘤中均能夠檢測到其過度表達(dá)[9-11］。BubR1和Cdc20是介導(dǎo)紡錘體組裝檢查點(diǎn)激活的關(guān)鍵成分,在哺乳動物中高度保守,其表達(dá)水平與紡錘體組裝檢查點(diǎn)功能之間存在劑量依賴性效應(yīng)[12-15］。本研究在引物的3′端分別設(shè)計了與突變序列相匹配的第1、2、3個堿基,菌落PCR結(jié)果顯示該方法可有效擴(kuò)增攜帶有突變型的質(zhì)粒,而野生型無PCR產(chǎn)物。

本研究進(jìn)一步使用了HDAC1 Y87F和c-JunP244A敲入突變細(xì)胞系以驗(yàn)證該方法檢測基因組DNA敲入突變的效率。HDAC1基因編碼的蛋白質(zhì)屬于組蛋白脫乙酰酶家族,在真核基因表達(dá)的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[16-17］。c-Jun參與包括細(xì)胞增殖、凋亡、存活、腫瘤發(fā)生和組織形態(tài)發(fā)生等多種細(xì)胞活動。有研究表明細(xì)胞外信號可以誘導(dǎo)c-Jun的翻譯后修飾,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性和靶基因表達(dá)的改變[18-20］。為了保護(hù)供體DNA不會被Cas9內(nèi)切酶重復(fù)切割,在不改變編碼氨基酸的情況下,分別對模板DNA上的PAM序列進(jìn)行了同義突變(TCG→AGT,TC→AG)。結(jié)果顯示,在引物的3′端引入與突變序列相匹配堿基可有效區(qū)分親本和敲入突變基因組。

以上結(jié)果證實(shí)無論是細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外突變,該方法只需要增加一步菌落PCR或者基因組PCR即可成功篩選陽性克隆,對一個或幾個陽性克隆進(jìn)行測序即可獲得所需的突變體,顯著地提高了突變體篩選的效率。本研究還進(jìn)一步優(yōu)化了PCR的退火溫度,引入額外的突變位點(diǎn)增加該方法的特異性,并考察了不同DNA聚合酶的應(yīng)用效果。

基于本研究的結(jié)果,為提高該方法的擴(kuò)增效率和特異性,我們提出以下建議:①使用普通的Taq酶。②盡量使用3′端含有2或3個甚至更多的與突變序列匹配的引物進(jìn)行克隆的快速篩選。如果只能使用含有1個突變核苷酸的引物,則可通過提高退火溫度或在引物3′端的倒數(shù)第2至第4個核苷酸中的任意一個位點(diǎn)引入單個突變堿基,以減少假陽性的產(chǎn)生。③在使用CRISPR/Cas9進(jìn)行敲入突變時,需要將DNA模板的PAM位點(diǎn)進(jìn)行突變來避免模板被Cas9識別切割。我們建議在設(shè)計引物時將突變后的PAM位點(diǎn)的DNA序列也引入引物中,從而提高篩選的特異性。④需要注意的是,該方法僅適合于敲入細(xì)胞系的篩選。對于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除,由于基因敲除結(jié)果不可預(yù)測,無法使用該方法來篩選基因敲除細(xì)胞。

綜上所述,本研究建立并且優(yōu)化了一種通過一步PCR就能夠快速地篩選出體外定點(diǎn)突變體或者CRISPR/cas9介導(dǎo)的敲入突變體的方法,簡化了突變體的鑒定過程,有效降低了實(shí)驗(yàn)成本,提高了工作效率。

作者聲明：宋春林、張剛、王穎參與了研究設(shè)計;宋春林、張雨晴、翟玉靜完成了實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)整理;宋春林、張剛、王穎完成了數(shù)據(jù)分析和論文的寫作;宋春林、張雨晴、翟玉靜完成了論文的校對。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。