高笑 吳清蘭 鄧林 宋軍瑩 張麗 欒業(yè)鵬 張金平 侯琳

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,山東 青島 266071; 2 青島大學(xué)藥學(xué)院; 3 中國人民解放軍海軍第971醫(yī)院)

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤,盡管在診斷和治療方面取得了重大進(jìn)展,但晚期乳腺癌患者的預(yù)后仍然非常不理想[1-3］。由于乳腺癌具有高度異質(zhì)性,單一靶點(diǎn)藥物通常會(huì)出現(xiàn)敏感性差、毒副作用大、易產(chǎn)生耐藥性等問題[4-5］。因此,新型雙靶點(diǎn)小分子化合物的研發(fā)為解決這一問題提供了新的希望。

熱休克蛋白90(Hsp90)是一種常見的分子伴侶蛋白,與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān),且在乳腺癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)[6-7］。另外,負(fù)責(zé)調(diào)控組蛋白乙?；^程的去乙?；?HDAC)也在乳腺癌的發(fā)展過程中起著非常重要的作用[8］。大量研究顯示,HDAC抑制劑與Hsp90抑制劑聯(lián)合用藥對(duì)多種腫瘤的治療有效[9-12］,但目前在乳腺癌治療中的研究未見報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)新型Hsp90/HDAC雙靶點(diǎn)抑制劑FXX-W-12-4對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用[13］。在此基礎(chǔ)上,本研究通過探討FXX-W-12-4對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231抗腫瘤的作用及機(jī)制,旨在為Hsp90/HDAC雙靶點(diǎn)抑制劑的研發(fā)以及乳腺癌的治療提供有益的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231由青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;CCK-8試劑盒以及BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司);GAPDH抗體、ac-H3抗體以及Hsp70抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司);Akt抗體、p-Akt抗體、mTOR抗體、p-mTOR抗體(上海賽信通生物試劑有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.12胎牛血清及體積分?jǐn)?shù)0.01青鏈霉素混合溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期且密度適宜時(shí),用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FXX-W-12-4對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞,加入胰酶消化后接種至96孔板中,每孔約2 000個(gè)細(xì)胞。24 h后細(xì)胞貼壁且生長密度適宜時(shí),將原培養(yǎng)液吸出,更換為含有不同濃度FXX-W-12-4(0、20、40、100、200、400、800 nmol/L)完全培養(yǎng)基。邊緣孔中加入無菌的PBS,防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。將96孔板放入37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,每孔加入CCK-8試劑10 μL繼續(xù)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長450 nm處各孔吸光度值,并計(jì)算細(xì)胞活力及半致死濃度(IC50),作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中濃度設(shè)定的參考值。

1.3.2劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FXX-W-12-4對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響 將處于對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中,每孔約5 000個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí),使用1 000 μL槍頭垂直于培養(yǎng)板進(jìn)行劃痕。使用無菌PBS洗去刮下的懸浮細(xì)胞后,每孔加入2 mL不含血清的培養(yǎng)基。將6孔板放入培養(yǎng)箱當(dāng)中繼續(xù)培養(yǎng)12 h后,根據(jù)前面計(jì)算獲得的IC50的參考值,加入FXX-W-12-4終濃度為0、100、200、300 nmol/L(分別為A、B、C、D組)的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),各組細(xì)胞分別在培養(yǎng)第0、12、24、48 小時(shí)時(shí)用普通倒置顯微鏡拍照,并計(jì)算劃痕面積。

1.3.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FXX-W-12-4對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響 取Transwell小室放入24孔板中,將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell上室中,置于培養(yǎng)箱中孵育1 h使其凝固。取對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞,胰酶消化后用無血清培養(yǎng)基重懸后,鋪于Transwell上室中,每孔約20 000個(gè)細(xì)胞,同時(shí)上室加入200 μL無血清培養(yǎng)基,下室加入800 μL完全培養(yǎng)基。于上室與下室中同時(shí)加入FXX-W-12-4使其終濃度為0、100、200、300 nmol/L(分別為A、B、C、D組)。將24孔板置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,取出小室。用棉簽輕輕擦去上室中的細(xì)胞和基質(zhì)膠,PBS輕輕沖洗3次。40 g/L的多聚甲醛固定后,采用0.1%的結(jié)晶紫染液染色下室中細(xì)胞,顯微鏡下觀察,隨機(jī)選取5個(gè)100倍的視野進(jìn)行拍照,并計(jì)算細(xì)胞侵襲率。

1.3.4Western Blot實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)FXX-W-12-4對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中ac-H3、Hsp70、Akt、mTOR、p-Akt及p-mTOR蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量的影響 將MDA-MB-231細(xì)胞采用終濃度分別為0、100、200、300 nmol/L的FXX-W-12-4(分別為A、B、C、D組)處理48 h,PBS清洗3次,洗去懸浮細(xì)胞和雜質(zhì)。加入RIPA蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)蛋白濃度。蛋白樣品于SDS-PAGE上電泳, PVDF轉(zhuǎn)膜后,以50 g/L的脫脂奶粉溶液常溫封閉2 h,TBST清洗3次,一抗4 ℃下孵育過夜,TBST清洗4次,二抗常溫孵育1 h。用ECL發(fā)光液按說明書進(jìn)行孵育,成像儀顯影并進(jìn)行拍照。以GAPDH的條帶結(jié)果為內(nèi)參,將目的蛋白的條帶與內(nèi)參條帶進(jìn)行比較,并計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 FXX-W-12-4對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響及其IC50值

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,以終濃度為0、20、40、100、200、400、800 nmol/L的FXX-W-12-4處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h后,MDA-MB-231細(xì)胞活力分別為(99.46±0.56)%、(91.38±0.79)%、(78.46±0.88)%、(74.59±0.93)%、(45.50±1.02)%、(41.69±0.79)%、(37.47±1.05)%。隨著FXX-W-12-4濃度的遞增,MDA-MB-231細(xì)胞的活力逐漸下降(F=2 663.00,P<0.05)。通過計(jì)算得出FXX-W-12-4作用MDA-MB-231細(xì)胞48 h后的IC50值為309.80 nmol/L。小于IC50值的濃度對(duì)細(xì)胞無毒性,因此選用0、100、200、300 nmol/L為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度。

2.2 各組MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的比較

重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示,組別、時(shí)間及其交互作用對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力均具有顯著性的影響(F組別=242.53,F時(shí)間=341.78,F組別*時(shí)間=152.14,P<0.05)。單獨(dú)效應(yīng)分析結(jié)果顯示,隨著時(shí)間的延長,A～D組MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力逐漸增強(qiáng)(F=34.14～153.46,P<0.05);與A組相比,B～D組細(xì)胞在第12、24、48小時(shí)時(shí)的遷移能力明顯降低(F=86.47～212.59,P<0.05)。見表1。

2.3 各組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力比較

Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,A～D組的細(xì)胞侵襲率分別為(89.99±6.12)%、(62.84±2.34)%、(30.07±4.62)%、(12.24±2.27)%。隨著FXX-W-12-4濃度的升高,MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力逐漸降低(F=68.67,P<0.05)。各組間兩兩比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.14～11.92,P<0.05)。見圖1。

表1 各組MDA-MB-231細(xì)胞遷移率比較

2.4 各組MDA-MB-231細(xì)胞中ac-H3、Hsp70及p-Akt、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,與A組相比較,B～D組ac-H3、Hsp70蛋白相對(duì)表達(dá)量隨FXX-W-12-4濃度增加明顯升高(F=645.60、1 017.00,P<0.05)。而p-Akt、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量隨FXX-W-12-4濃度的升高則明顯降低(F=480.30、14.32,P<0.05);各組間兩兩比較差異均具有顯著性(t=9.43～45.38,P<0.05)。見表2。

3 討 論

乳腺癌作為女性常見的全身性惡性腫瘤,具有增殖能力強(qiáng)、易侵襲和易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn),這是多數(shù)乳腺癌患者死亡的重要原因,且晚期患者5年生存率相對(duì)較低[14］。近年來,腫瘤靶向治療已經(jīng)成為治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)方向,也為乳腺癌治療帶來了新的希望。與傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療、激素治療等方法相比較,靶向治療可以精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞[15］。但是,單一靶點(diǎn)藥物往往會(huì)出現(xiàn)治療范圍有限、副作用大、易產(chǎn)生耐藥性等問題。多靶點(diǎn)藥物可以同時(shí)作用于多個(gè)靶點(diǎn),發(fā)揮多重抗腫瘤作用,顯著減少單一靶點(diǎn)或聯(lián)合用藥的局限性。因此,多靶點(diǎn)小分子化合物的研發(fā)對(duì)腫瘤的治療有重要意義。

A～D分別為A～D組,結(jié)晶紫染色法,100倍

表2 各組MDA-MB-231細(xì)胞中ac-H3、Hsp70、p-Akt、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

Hsp90是細(xì)胞內(nèi)一種重要的分子伴侶蛋白,它可以與其他蛋白結(jié)合并協(xié)助它們完成正確折疊、維持功能和降解[6-7］。然而,Hsp90的過度表達(dá)和功能紊亂會(huì)影響多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路和多種生物學(xué)行為,從而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16-17］。研究表明,Hsp90在乳腺癌中表達(dá)異常升高,并且與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)[18-19］。因此,Hsp90已經(jīng)成為乳腺癌治療中備受關(guān)注的靶點(diǎn)之一。另外,表觀遺傳修飾在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用[8］。其中,組蛋白的乙?；腿ヒ阴；亲畛Ｒ姷男揎椃绞?由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和HDAC共同調(diào)節(jié)[20］。在乳腺癌等多種疾病中,HDACs的表達(dá)異常升高,成為治療癌癥的熱門分子靶點(diǎn)之一[21］。通過抑制HDAC的活性,可以促進(jìn)組蛋白的去乙?；揎?從而恢復(fù)基因的正常表達(dá),抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[22］。研究顯示,HDAC抑制劑與Hsp90抑制劑聯(lián)合用藥量有協(xié)同抗腫瘤作用[23-27］。目前的研究發(fā)現(xiàn),LMK235(HDAC抑制劑)以及NVP-HSP990(Hsp90抑制劑)聯(lián)用可以顯著性抑制卵巢癌細(xì)胞A2780中Hsp90和HDAC雙靶點(diǎn)的活性,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[28］。此外,LMK235和NVP-HSP990聯(lián)合治療還可顯著降低A2780細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的獲得性耐藥,從而實(shí)現(xiàn)鉑類藥物的逆轉(zhuǎn)作用。17-DMAG(Hsp90抑制劑)與PTACH(HDAC抑制劑)聯(lián)用能夠增加細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,從而誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡,并使細(xì)胞遷移能力幾乎喪失[29］。因此Hsp90和HDAC可作為比較理想的篩選雙靶點(diǎn)抗腫瘤藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)。然而,Hsp90/HDAC雙靶點(diǎn)抑制劑在乳腺癌中的研究尚未見報(bào)道。

針對(duì)乳腺癌增殖能力強(qiáng)、易侵襲和轉(zhuǎn)移的特質(zhì),本研究對(duì)FXX-W-12-4在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的抑制作用進(jìn)行了深入探究。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FXX-W-12-4對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響,結(jié)果顯示隨著FXX-W-12-4濃度的升高,MDA-MB-231細(xì)胞活力逐漸下降,FXX-W-12-4顯著抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。本研究采用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)FXX-W-12-4對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響,結(jié)果顯示梯度濃度的FXX-W-12-4作用于MDA-MB-231細(xì)胞后,細(xì)胞遷移率和侵襲率均明顯下降,這表明FXX-W-12-4顯著抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲的能力。為了探討FXX-W-12-4是否通過抑制Hsp90和HDAC雙靶點(diǎn)的活性,從而對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲與遷移發(fā)揮作用,本研究通過Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了FXX-W-12-4作用MDA-MB-231細(xì)胞以后Hsp70和ac-H3蛋白的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示,經(jīng)FXX-W-12-4處理后,MDA-MB-231細(xì)胞中Hsp70、ac-H3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著增加,同時(shí)p-Akt和p-mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低。這表明FXX-W-12-4對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用可能是通過抑制Hsp90和HDAC雙靶點(diǎn)的活性,從而影響Akt/mTOR通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,本研究以新型Hsp90/HDAC雙靶點(diǎn)抑制劑FXX-W-12-4為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)該小分子化合物對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移具有顯著的抑制作用,其抑制作用可能是通過調(diào)節(jié)Akt/mTOR通路實(shí)現(xiàn)的。FXX-W-12-4有望成為一種治療乳腺癌的新的有效化合物,具有樂觀的臨床應(yīng)用前景。本研究為小分子雙靶點(diǎn)藥物的研發(fā)提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

作者聲明：高笑、吳清蘭、鄧林、宋軍瑩參與了實(shí)驗(yàn)的研究設(shè)計(jì)工作;高笑、張麗、欒業(yè)鵬、張金平、侯琳參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。