肖歡歡 尹侃 肖雨 張崢 侯琳

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,山東 青島 266071;2 青島微能生命科技集團有限公司; 3 濱州醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種常見的進行性神經(jīng)退行性疾病,其主要原因是黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的選擇性死亡,目前的治療方法主要是通過左旋多巴(一種多巴胺前體)增強正常運動所需的多巴胺能信號來改善癥狀[1],但是長期使用會使藥物敏感性降低。至今尚沒有可以減緩疾病進展或防止神經(jīng)變性的有效方法,臨床迫切需要尋找治療PD新的靶點和生物標志物。

間充質(zhì)干細胞(MSCs)條件培養(yǎng)基(CM)對PD有刺激神經(jīng)發(fā)生和減少神經(jīng)炎癥的作用,但是具體作用機制還不是很明確。以前針對MSCs的研究多是使用骨髓MSCs(BM-MSCs)[2],目前可從脂肪組織[3]、牙髓[4]、子宮內(nèi)膜[5]、皮膚[6]、羊水[7]、胎盤[8]和臍帶血[9]中分離獲取。由于皮下脂肪組織豐富,易于獲取,并且具有最低限度的倫理考慮[10],因此,在各類的成體干細胞中,使用人脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSCs)的研究越來越多[11]。本研究通過1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞損傷來模擬環(huán)境毒素導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷,探討ADSCs-CM對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞線粒體功能的影響及其作用機制,為進一步尋找PD治療靶點和開發(fā)PD的新治療策略奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

人神經(jīng)母細胞瘤細胞系(SH-SY5Y)購自美國細胞培養(yǎng)物收藏中心(ATCC),ADSCs-CM由青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院干細胞再生醫(yī)學(xué)研究院提供。二辛可寧酸測定(BCA)試劑盒、線粒體復(fù)合物Ⅰ(CⅠ)活性測定試劑盒購買于北京索萊寶科技有限公司,MPP+(德國Sigma公司),JC-1試劑盒(上海愛必信生物科技有限公司),活性氧(ROS)檢測試劑盒、三磷酸腺苷(ATP)測定試劑盒線、粒體提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),兔抗人LC3/P62(英國Abcam公司)。

1.2 細胞的處理和分組

將SH-SY5Y細胞于含體積分數(shù)0.10胎牛血清和體積分數(shù)0.01青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),隔天更換一次培養(yǎng)基,每2～3 d傳代一次。將生長密度達到70%～80%的SH-SY5Y細胞分為Ctrl組、PD組和CM組,Ctrl組于完全培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),PD組在完全培養(yǎng)基中加入1.0 mmol/L的MPP+以構(gòu)建PD細胞模型[12],將CM組置于含有1.0 mmol/L MPP+的ADSCs-CM中進行培養(yǎng),均培養(yǎng)24 h。

1.3 研究方法

1.3.12,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光方法檢測SH-SY5Y細胞中ROS的含量 取處理24 h的各組SH-SY5Y細胞,去除原有的細胞培養(yǎng)液后,加入1 mL用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋的終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA,37 ℃下孵育20 min,然后用無血清細胞培養(yǎng)基沖洗細胞3次,完全去除細胞表面的DCFH-DA,通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光強度。

1.3.2ATP測定試劑盒測定SH-SY5Y細胞中ATP總量 取處理24 h的各組SH-SY5Y細胞,嚴格按照ATP測定試劑盒測定方法操作,并使用具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標儀來測定各組SH-SY5Y細胞中ATP總量。

1.3.3各組SH-SY5Y細胞中線粒體CⅠ酶活性的測定 取處理24 h的各組SH-SY5Y細胞,嚴格按照線粒體提取試劑盒的提取方法提取線粒體蛋白,然后于線粒體蛋白中加入提取緩沖液,按照線粒體CⅠ活性測定試劑盒的操作要求,測定線粒體CⅠ的活性。

1.3.4單丹磺酰尸胺(MDC)熒光法觀察細胞自噬在處理24 h的各組SH-SY5Y細胞的6孔板中,每孔加入1 mL MDC染色液,置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱當(dāng)中避光孵育30 min。吸棄MDC染色液并使用1 mL Assay Buffer洗滌3次。最后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。

1.3.5Western blot實驗檢測SH-SY5Y細胞中P62、LC3蛋白相對表達量 在處理24 h的各組SH-SY5Y細胞中加入含有1 mmol/L苯甲烷磺酰氟的緩沖液(RIPA),采用放射免疫沉淀法提取細胞中總蛋白,并用BCA蛋白分析試劑盒對提取的蛋白進行定量。將等量的蛋白樣品(30 μg)用體積分數(shù)0.10的SDS-PAGE分離膠,轉(zhuǎn)移到PVDF上,室溫下用體積分數(shù)0.05的牛血清白蛋白(BSA)封閉3 h后,與一抗4 ℃孵育過夜。然后將二抗(1∶5 000)在室溫下孵育1 h。使用增強化學(xué)發(fā)光試劑顯現(xiàn)反應(yīng)條帶,使用ImageG-Pro Plus6軟件分析目的蛋白條帶P62、LC3和內(nèi)參蛋白條帶GAPDH的灰度值,將目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值進行比較,得出目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 各組SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS含量比較

Ctrl組、PD組、CM組SH-SY5Y細胞ROS含量分別為1.00±0.00、2.23±0.41、0.74±0.06,組間比較差異顯著(F=33.46,P<0.05)。其中,PD組與Ctrl組、CM組與PD組細胞中ROS含量比較差異均有顯著性(tLSD=5.21、6.26,P<0.05),Ctrl組與CM組細胞中ROS含量比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖1。

2.2 各組SH-SY5Y細胞中ATP總量比較

Ctrl組、PD組、CM組SH-SY5Y中ATP總量分別為0.24±0.04、0.13±0.02、0.27±0.06,組間比較差異有顯著性(F=8.79,P<0.05)。其中,PD組與Ctrl組、CM組與PD組細胞的ATP總量比較差異均有顯著性(tLSD=4.00、4.02,P<0.05),Ctrl組與CM組細胞的ATP總量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組SH-SY5Y細胞中線粒體CⅠ活性的比較

Ctrl組、PD組、CM組SH-SY5Y細胞中線粒體CⅠ的活性分別為19.40±1.14、10.85±3.06、18.92±3.06,組間比較差異有顯著意義(F=10.36,P<0.05)。其中,PD組與Ctrl組,CM組與PD組細胞線粒體CⅠ活性比較差異均有顯著意義(tLSD=4.53、3.23,P<0.05),Ctrl組與CM組細胞線粒體CⅠ活性比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.4 各組SH-SY5Y細胞自噬水平的比較

MDC熒光染色法觀察各組SH-SY5Y細胞自噬情況,Ctrl組、PD組、CM組細胞自噬率分別為1.00±0.00、0.44±0.08、1.33±0.31,三組間比較有顯著差異(F=18.21,P<0.05)。其中,PD組與Ctrl組、CM組與PD組比較差異均具有顯著意義(tLSD=12.61、4.88,P<0.05),Ctrl組較CM組細胞自噬率比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖2。

圖1 各組SH-SY5Y細胞中ROS含量(DCFH-DA染色,400倍)

2.5 各組SH-SY5Y細胞中P62、LC3蛋白相對表達量比較

Western blot結(jié)果顯示,Ctrl組、PD組、CM組SH-SY5Y細胞中P62蛋白相對表達水平為1.00±0.00、1.26±0.05、1.10±0.05,LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達水平為1.00±0.00、0.78±0.09、1.11±0.05,組間比較差異有顯著性(F=28.61、28.61,P<0.05);PD組與Ctrl組細胞中P62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量比較差異均有顯著性(tLSD=8.78、4.47,P<0.05),CM組與PD組細胞中P62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量比較差異均有顯著意義(tLSD=3.80、5.96,P<0.05),Ctrl組與CM組細胞中P62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖3。

3 討 論

PD作為一種神經(jīng)退行性疾病,影響著世界上數(shù)百萬人的身體健康和正常生活。PD潛在的發(fā)病機制和切實有效的治愈方法至今仍不明確,目前的治療方法也只能緩解患者運動障礙等癥狀,但不能阻止PD進展,也不能延長多巴胺能神經(jīng)元存活時間。

圖3 各組SH-SY5Y細胞中P62、LC3蛋白表達水平

干細胞移植已經(jīng)成為治療PD等神經(jīng)退行性疾病的一項非常有效的方法。最近的證據(jù)表明,干細胞移植的治療機制不是因為其具有直接分化能力,而是因為其分泌的生物活性分子發(fā)揮了相應(yīng)的作用。MSCs來源的分泌體系在為受損的組織提供再生微環(huán)境的同時[13],還可以避免干細胞移植的副作用[14-15]。目前干細胞移植中存在的問題主要有移植細胞分化差、植入率和成活率低、有可能激活異體免疫排斥等[16]。干細胞所分泌的生物活性分子可以提供一個再生微環(huán)境,縮減損傷區(qū)域,建立一個自我調(diào)節(jié)的再生反應(yīng)體系[17-18]。研究顯示,MSCs-CM對PD有刺激神經(jīng)發(fā)生和減少神經(jīng)炎癥的作用。盡管MSCs-CM有神經(jīng)保護作用,但其仍然有其治療的局限性[17-18]。

線粒體功能障礙引起的神經(jīng)元氧化應(yīng)激在PD的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用?；謴?fù)線粒體功能和抑制氧化應(yīng)激已成為PD受損神經(jīng)元修復(fù)的關(guān)鍵療法。本研究通過DCFH-DA染色方法對各組的SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS含量進行比較,研究結(jié)果表明,與Ctrl相比,PD組細胞的ROS含量明顯升高,與PD相比,CM組細胞的ROS產(chǎn)生量顯著降低,提示ADSCs-CM可降低MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞中ROS的含量。在應(yīng)激條件下,有缺陷線粒體數(shù)量增加,產(chǎn)生大量活性氧,細胞內(nèi)ROS無法及時清除[19]。線粒體是參與ROS生成的主要的細胞器[20],ROS過量的產(chǎn)生使得細胞的抗氧化效率降低從而導(dǎo)致細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,對線粒體產(chǎn)生不利的氧化修飾,這種現(xiàn)象在許多涉及線粒體功能障礙的神經(jīng)退行性疾病當(dāng)中均可以觀察到[21]。本研究ATP合成測定結(jié)果表明,與Ctrl組相比,PD組細胞的ATP總量明顯降低,與PD組相比,CM組細胞的ATP總量明顯升高,提示在MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞中,ADSCs-CM促進了ATP的生成。ROS的過度積累會導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔異常開放,線粒體膜電位下降[22]。線粒體膜電位是ATP合成的驅(qū)動力,線粒體膜電位下降會導(dǎo)致細胞內(nèi)ATP總量降低。本研究線粒體CⅠ活性測定結(jié)果表明,與Ctrl組相比,PD組細胞的線粒體CⅠ活性明顯降低,與PD組相比較,CM組細胞的線粒體CⅠ活性明顯升高,提示在MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y中,ADSCs-CM提升了線粒體CⅠ的活性。由于細胞內(nèi)ATP總量與線粒體CⅠ的活性相關(guān),那么在ATP合成減少的細胞中,線粒體CⅠ活性也是降低的。本研究MDC熒光染色法結(jié)果表明,與Ctrl組相比,PD組細胞的自噬率明顯降低,而與PD組相比,CM組細胞的自噬率明顯升高。Western blot結(jié)果表明,PD組與Ctrl組、CM組比較,細胞中P62蛋白相對表達量顯著升高、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量顯著降低。這表明在MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞中,ADSCs-CM可顯著降低細胞自噬水平。自噬作為一個獨立的系統(tǒng),可降解體內(nèi)受損的蛋白質(zhì)和細胞器。在正常情況下,自噬處于動態(tài)平衡,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),但在大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病中線粒體存在功能受損情況。研究發(fā)現(xiàn),ADSCs-CM可以導(dǎo)致線粒體自噬,從而清除受損線粒體,在氧化應(yīng)激相關(guān)的PD中發(fā)揮神經(jīng)保護作用[23]。

綜上所述,本研究旨在通過MPP+作用于SH-SY5Y細胞構(gòu)建PD細胞模型,檢測ROS的產(chǎn)生量以評估MPP+誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激情況,并確定細胞ATP的產(chǎn)生和線粒體CⅠ的活性以評估線粒體功能。通過分析P62和LC3-Ⅱ/Ⅰ表達以及細胞自噬率來評估ADSCs-CM對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞自噬的影響。研究數(shù)據(jù)表明,MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞線粒體功能障礙,而ADSCs-CM通過線粒體自噬清除受損線粒體,改善MPP+誘導(dǎo)的線粒體ATP合成減少、ROS和氧化應(yīng)激增加以及線粒體CⅠ活性不足的情況。

總之,本研究表明ADSCs-CM通過線粒體自噬的方式改善MPP+誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和體外氧化應(yīng)激反應(yīng),為PD的診斷以及治療提供了新思路。但是ADSCs-CM靶向調(diào)控P62/LC3通路在MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞中發(fā)揮神經(jīng)保護作用的具體機制還需要進一步研究。

作者聲明：肖歡歡、尹侃參與了研究設(shè)計;肖雨、張崢、侯琳參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。