鄭晴晴 李超 李巖 喬炳龍 馬春玲

(1 青島大學醫(yī)學部,山東 青島 266071; 2 棗莊市市中區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科;3 青島大學附屬醫(yī)院產(chǎn)科; 4 青島大學附屬醫(yī)院放射科)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)在世界范圍的發(fā)病率約為16%,一旦發(fā)病會明顯增加不良妊娠結局的發(fā)生率[1-2]。炎癥反應、滋養(yǎng)細胞功能障礙等是影響GDM進程的因素[3-4]。近年來研究表明機體自噬水平變化對GDM的進展也起到一定作用[5]。目前胰島素注射為GDM的主要治療方式,但其存在使用不便、注射依從性差等缺點[6]。而褪黑素在部分實驗中被證實可控制血糖濃度及調節(jié)機體的自噬水平[7-8]。但目前關于褪黑素對GDM中胰腺組織自噬影響的研究較少,本研究首次探討了褪黑素對GDM大鼠胰腺自噬的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

褪黑素購自美國MCE生物技術有限公司,HE染色液購自北京索萊寶科技有限公司,葡萄糖及糖化血紅蛋白檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所,胰島素試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物有限公司,Tunel細胞凋亡染色液購自上海碧云天生物技術有限公司,兔單抗甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)、Beclin1、磷脂磷肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)均購買于武漢愛博泰克生物技術有限公司,兔多抗磷酸化PI3K(p-PI3K)購自英國Abcam生物技術有限公司,兔單抗磷酸化AKT(p-AKT)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及磷酸化mTOR(p-mTOR)購自美國CST生物技術有限公司。

1.2 動物造模和分組

SPF級的Wistar大鼠購自湖北實驗動物研究中心[動物許可證號SCXK(鄂)2020-0018],體質量250～270 g。將大鼠在溫度(23.0±2.0)℃、濕度(52.5±12.5)%的條件下適應性飼養(yǎng)7 d以后造模[9-10]。造模前大鼠禁食不禁水12 h,然后測定大鼠空腹血糖,選取血糖值≤6.1 mmol/L的雌性大鼠共28只納入實驗,并隨機分為正常妊娠組(A組)、GDM組(B組)、GDM褪黑素低劑量組(C組)以及GDM褪黑素高劑量組(D組),每組7只。將各組雌性大鼠與雄性大鼠按2∶1比例進行合籠,次日取雌性大鼠陰道分泌物制作涂片,通過顯微鏡檢測有無精子,涂片有精子的雌性大鼠記做妊娠第0天,無精子的雌性大鼠重復上述合籠步驟直至受孕。妊娠第0天,A組大鼠腹腔注射枸櫞酸鹽緩沖液,其余組大鼠腹腔注射45 mg/kg鏈脲佐菌素溶液誘導GDM模型。妊娠第3天,A組大鼠正常飼養(yǎng),B～D組大鼠麻醉后用醫(yī)用棉片消毒鼠尾,剪去尾尖,棄掉第一滴血后檢測血糖濃度,血糖濃度≥16.7 mmol/L的大鼠即造模成功。造模結束后,A、B組大鼠每天灌胃10 mL/kg生理鹽水,C、D組大鼠每天分別灌胃5、10 mg/kg褪黑素[11],各組每天均灌胃1次,連續(xù)灌胃14 d后以戊巴比妥鈉(30 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉后處死各組大鼠,剪開大鼠胸腔取左心室血5 mL于4 ℃下保存。隨后剪開各組大鼠腹腔,取各組大鼠胰腺樣本,將每只大鼠的胰腺樣本分為3份,1份于40 g/L多聚甲醛中室溫保存用于病理染色,1份于戊二醛中于4 ℃下保存用于電鏡檢查,1份于-80 ℃凍存用于后續(xù)免疫印跡檢測。

1.3 各組大鼠血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平檢測

取各組大鼠的血液樣本,以3 000 r/min離心10 min,吸取上層血清樣本。根據(jù)相應商品試劑盒說明書對血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白含量進行測定。

1.4 HE染色觀察各組大鼠胰腺組織病理變化

取各組大鼠的胰腺組織,在40 g/L多聚甲醛中浸泡固定48 h,再通過乙醇梯度脫水、石蠟包埋及切片后通過蘇木素染色,1%鹽酸乙醇分化,伊紅復染封片后顯微鏡下采集圖片。

1.5 Tunel染色觀察各組大鼠胰腺細胞凋亡情況

取各組大鼠胰腺組織,在40 g/L多聚甲醛中浸泡固定48 h后,通過乙醇梯度脫水、石蠟包埋及切片后加蛋白酶K室溫孵育20 min,Tunel細胞凋亡染色液暗室孵育60 min,DAPI染色液染核,熒光封片劑封片后顯微鏡下拍照觀察胰腺細胞凋亡情況。

1.6 透射電鏡觀察各組大鼠胰腺組織細胞自噬

取各組大鼠胰腺組織,于電鏡固定液固定,脫水后樹脂滲透包埋,隨后制備切片進行醋酸鈾和檸檬酸鉛各染色5 min,透射電鏡下觀察拍照。

1.7 免疫印跡法檢測各組大鼠胰腺組織自噬相關蛋白的表達情況

將少量剪碎的各組大鼠胰腺組織勻漿、裂解后,提取總蛋白檢測蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品在SDS-PAGE上電泳,PVDF轉膜,封閉液室溫中孵育2 h,添加LC3、Beclin1、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR和mTOR及GAPDH一抗于4 ℃搖床孵育12 h,添加二抗室溫孵育2 h,ECL化學發(fā)光顯影,通過Image J軟件分析各個蛋白條帶的灰度值,并計算目的蛋白相對表達量。每組實驗重復3次,結果取均值。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 各組大鼠血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平比較

單因素方差分析顯示,各組大鼠血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平比較均有顯著差異(F=52.26～66.73,P<0.05)。與A組相比,B組大鼠血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平均顯著上升(t=-14.45～7.23,P<0.05);與B組相比,C、D組大鼠血清中葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平顯著下降(t=-5.32～10.02,P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平比較

2.2 各組大鼠胰腺組織病理變化比較

HE染色結果顯示,A組大鼠胰腺組織中胰島形態(tài)規(guī)則,細胞排列有序;B組大鼠胰島組織形態(tài)結構不規(guī)則,細胞間排列紊亂,胰島邊界不清晰,部分胰島細胞漿出現(xiàn)空泡變性;C組大鼠胰島形態(tài)趨于規(guī)則,細胞排列較為整齊,胰島與外分泌腺界限較為清晰;D組大鼠胰島形態(tài)規(guī)則,細胞排列整齊,胰島與外分泌腺界限清晰。見圖1。

2.3 各組大鼠胰腺組織細胞凋亡情況比較

Tunel染色結果顯示,與A組相比,B組大鼠胰腺組織細胞凋亡增加;與B組相比,C、D組大鼠胰腺組織細胞凋亡減少,且D組的細胞凋亡減少更加明顯。

注:黑色箭頭所指為胰島

2.4 各組大鼠胰腺組織自噬情況比較

透射電鏡觀察結果顯示,A組大鼠胰腺組織中可見明顯且清晰的線粒體及內質網(wǎng)等細胞器結構,無明顯的自噬體出現(xiàn);B組大鼠胰腺組織中可見細胞核出現(xiàn)固化、碎裂,核膜皺縮不清,出現(xiàn)明顯自噬體;C、D組可見細胞質中線粒體、內質網(wǎng)、細胞核等結構基本正常,并有少量自噬體。見圖2。

2.5 各組大鼠胰腺組織中自噬相關蛋白的相對表達水平比較

免疫印跡法檢測結果顯示,各組大鼠胰腺組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平及Beclin1相對表達量比較均有顯著差異(F=27.68～67.72,P<0.05),與A組相比,B組大鼠胰腺組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平和Beclin1相對表達量顯著上升(t=-8.13～-6.83,P<0.05),p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平則均顯著下降(t=8.83～14.05,P<0.05);與B組相比,C、D組大鼠胰腺組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平和Beclin1相對表達量均顯著下降(t=3.36～6.95,P<0.05),而p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的水平則均顯著上升(t=-9.64～-3.51,P<0.05)。見表2。

圖2 透射電鏡觀察各組大鼠胰腺組織自噬情況(7 800倍)

表2 各組大鼠胰腺組織自噬相關蛋白表達水平比較

3 討 論

研究表明,全球孕婦中約有6～9%患有糖尿病,而其中約90%為GDM患者[12]。目前胰島素治療GDM有較好效果,但胰島素存在使用不便、成本高昂等缺點[13],因此探尋GDM治療的新型藥物是科研工作者關注的熱點。褪黑素可調節(jié)多種生命活動,如調節(jié)衰老、焦慮和免疫反應等[14-15]。有研究表明褪黑素對GDM具有一定治療作用。LIU等[16]研究表明,褪黑素能調節(jié)ERK通路誘導神經(jīng)干細胞增殖,進而能夠防止GDM小鼠子代神經(jīng)畸形。DE MELO等[17]研究表明,褪黑素能減少GDM大鼠胎兒身長及體質量異常。孫平等[11]研究也表明,褪黑素能下調GDM大鼠血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平。本研究中,與B組相比,D組大鼠血清葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平下降,胰腺組織病理損傷及凋亡減輕,與既往研究結果類似。血清糖化血紅蛋白水平能夠反映過去一段時間機體的血糖水平,胰島素能降低機體血糖含量,GDM大鼠血清葡萄糖的降低能一定程度控制疾病的進展。故提示褪黑素能減輕GDM大鼠胰腺的損傷。

近年來,胎盤自噬、滋養(yǎng)細胞自噬等在GDM疾病的進展中得到越來越多的關注。目前研究最廣泛的自噬類型是巨自噬,其為降解受損細胞器和蛋白質的主要途徑。基于不同的環(huán)境(如缺氧、缺血等),滋養(yǎng)細胞自噬的發(fā)生既可一定程度增加細胞的生存能力,也能夠誘導細胞死亡[18]。自噬的調控機制錯綜復雜,PI3K/AKT/mTOR通路是其主要調控通路。PI3K/AKT/mTOR信號通路中PI3K能夠激活AKT磷酸化,繼而調節(jié)mTOR磷酸化,抑制自噬進程[19]。近年來文獻表明,胰島與GDM的進展有著重要的聯(lián)系,ZHAO等[20]研究表明miRNA-221可通過靶向PAK1調節(jié)胰島β細胞的增殖,降低GDM誘導的胰島功能障礙;ZHANG等[21]研究表明黃芪甲苷能抑制GDM小鼠胰腺中NLRP3炎性小體形成;邢寶恒等[22]研究證明白藜蘆醇可以增加GDM大鼠胰島素的分泌,改善胰腺組織病變。但GDM與胰腺組織自噬關系的研究報道較少?；诒狙芯恐型屎谒啬軠p輕GDM大鼠胰腺損傷的結果,我們進一步檢測了GDM大鼠胰島組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平和Beclin1相對表達量及自噬經(jīng)典通路PI3K/AKT/mTOR的變化。本研究結果表明,與B組大鼠相比較,D組大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平及Beclin1相對表達量均有顯著下降,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR水平升高,說明褪黑素能激活GDM大鼠胰腺組織中PI3K/AKT/mTOR信號通路,從而抑制自噬水平。而自噬水平的降低能夠一定程度緩解高水平自噬誘導的細胞死亡,從而減輕組織病理損傷[23-25]。因此上述研究結果表明褪黑素可能通過調節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制GDM大鼠胰腺組織中過高水平的自噬,從而減輕胰腺組織的病理損傷。

綜上所述,褪黑素能夠改善GDM大鼠血糖濃度以及胰腺組織的病理損傷,其具體機制可能和調控PI3K/AKT通路抑制胰腺組織的異常高水平自噬有關。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學醫(yī)學部倫理委員會的審核批準(文件號QYFYECKY-2022-002-11)。所有實驗過程均遵照《動物實驗管理守則》的條例進行。

作者聲明：鄭晴晴、李超、李巖、喬炳龍和馬春玲參與了研究設計;鄭晴晴、李超、李巖參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。