李程琳 王梓聿 曹丁元 國超凡 王爽 李玲

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266071)

腫瘤細胞為躲避免疫清除而建立的免疫逃避機制,可使機體對腫瘤細胞產(chǎn)生免疫耐受[1-2]。如何打破免疫耐受,防止腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)是目前和未來臨床治療的難題[3]。放療和化療作為目前臨床腫瘤治療的標準療法,在抑制腫瘤細胞生長的同時也破壞了自身免疫系統(tǒng),不利于術(shù)后機體的免疫重建[4]。光熱治療是一種新興的腫瘤治療方法,也是國內(nèi)外研究的熱點,其治療機理是可以在局部殺滅腫瘤細胞,并且對機體免疫系統(tǒng)損傷程度較輕[5-7],但是腫瘤患者機體處于免疫耐受狀態(tài),經(jīng)光熱治療后仍然無法避免腫瘤的復(fù)發(fā)[8]。既往研究發(fā)現(xiàn),木犀草素(LUT)作為腫瘤疫苗佐劑,可以有效激活抗原提呈細胞(APC)和CD8+T細胞對于腫瘤細胞的殺傷功能[9]。目前在抗腫瘤治療中,光熱治療聯(lián)合佐劑的相關(guān)研究未見報道。新興的光熱材料如聚多巴胺(PDA),因其具有的良好光熱轉(zhuǎn)換效率、生物相容性、安全性高和易載藥的特點[10],在光熱材料中被廣泛應(yīng)用。因此,本研究選用PDA與LUT聯(lián)合治療小鼠黑色素瘤,通過流式細胞術(shù)檢測小鼠免疫水平,為抗腫瘤免疫機制激活提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

LUT(MB6799)購買于大連美倫生物科技有限公司,CCK-8試劑盒02571100購買于上海雅酶生物科技有限公司,APC抗小鼠mouse CD11b抗體101212、PB450抗小鼠CD3抗體100334、FITC抗小鼠CD8a抗體100706、PE抗小鼠IFN-γ抗體505808、PE抗小鼠TNF-ɑ抗體506305、PE抗小鼠iNOS抗體696806、Alexa Fluor 700抗小鼠CD206抗體141734購自美國biolegend公司。

1.2 實驗動物與細胞

6～8周的齡雌性C57BL/6小鼠購買于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證:SCXK(京)2019-0010,將小鼠飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部潔凈動物室。RAW264.7細胞系和B16F10黑色素瘤細胞購自中國科學(xué)院上海細胞資源中心。RAW264.7細胞置于含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,B16F10細胞置于含體積分數(shù)為0.10胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,均培養(yǎng)于37 ℃、體積分數(shù)為0.05 CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

1.3 實驗方法

1.3.1PDA的制備以及鑒定 取0.19 g Tris,加入100 mL雙蒸水,攪拌2 min,快速加入0.121 g鹽酸多巴胺,用保鮮膜迅速封口,在保鮮膜上扎一個小孔,采用磁力攪拌器慢速攪拌24 h,離心并用蒸餾水清洗3次,取最后一次離心所得底物,放入冰箱冷凍12 h后,放入冷凍干燥機冷凍24 h后,合成實驗所需的PDA溶液。采用Phenom ProX掃描電子顯微鏡(SEM)觀察PDA表征,使用接觸角測定儀檢測接觸角的大小。

1.3.2CCK8法檢測PDA對RAW264.7細胞活性的影響 取對數(shù)生長期RAW264.7細胞,胰酶消化,接種至96孔板,密度為每孔5×108個細胞/L。待到細胞貼壁生長過夜以后,棄掉原培養(yǎng)液。將細胞分為Control組、脂多糖(LPS)組、PDA′組,每組設(shè)5個復(fù)孔。Control組細胞培養(yǎng)液不做任何處理,在LPS組、PDA′組細胞的培養(yǎng)液中分別加入LPS(2 μg/L)、PDA(50 000 μg/L),常規(guī)培養(yǎng)48 h。每孔加入CCK-8試劑100 μL孵育2 h,以酶標儀測定波長450 nm處的吸光度。

1.3.3流式細胞術(shù)檢測LUT對RAW264.7細胞分化的影響 取對數(shù)生長期RAW264.7細胞,胰酶消化,接種至96孔板,密度為每孔5×108個細胞/L。待細胞貼壁生長至對數(shù)生長期后,棄掉原培養(yǎng)液。設(shè)置Control組、IL-4組、LUT+IL-4組,每組設(shè)3個復(fù)孔。Control組細胞培養(yǎng)液不做任何處理,IL-4組、LUT+IL-4組細胞的培養(yǎng)液中分別加入IL-4(20 μg/L)、LUT(6 670 μg/L)+IL-4(20 μg/L),常規(guī)培養(yǎng)48 h,用PE抗小鼠iNOS抗體染色30 min。設(shè)置Control組、LPS組、LPS+LUT組,每組3個復(fù)孔。Control組細胞培養(yǎng)液不做任何處理,LPS組、LPS+LUT組細胞的培養(yǎng)液中分別加入LPS(2 μg/L)、LUT(6 670 μg/L)+LPS(2 μg/L),常規(guī)培養(yǎng)48 h以后,用Alexa Fluor 700抗小鼠CD206抗體染色30 min,用Beckman CytoFLEX進行檢測,以FlowJo V10軟件分析各組小鼠體內(nèi)巨噬細胞分化情況。

1.3.4動物分組及處理C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為模型組、PDA組、LUT組以及PDA+LUT組,每組16只,每只小鼠背部皮下注射2×106個B16F10細胞構(gòu)建黑色素瘤小鼠模型。建模第10天時,模型組和LUT組不注射PDA,PDA組以及PDA+LUT組小鼠在腫瘤局部注射PDA(2.5 μg/只),并采用紅外線儀(808 nm)照射腫瘤5 min,照射1次后立即使用熱成像儀采集小鼠熱能圖像。采集圖像后立即對LUT組和LUT+PDA組小鼠右大腿肌肉處注射LUT(500 μg/只),每天1次,連續(xù)3 d,模型組和PDA組不注射LUT。于治療結(jié)束后第2天,每組小鼠隨機取出5只,麻醉后脫頸處死,剖出黑色素瘤,測量計算黑色素瘤面積,計算公式為(π×長×寬)/4。另從每組小鼠中隨機取出5只,常規(guī)飼養(yǎng)至治療結(jié)束后第14天,觀察和記錄期間小鼠存活情況。

1.3.5流式細胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟組織中巨噬細胞的分化情況 治療結(jié)束后第3天,每組小鼠隨機取出3只,麻醉后脫頸處死,剖離脾臟,放于PBS中用研磨棒研磨,以1 500 r/min離心2 min,棄上清后加入紅細胞裂解液,顛倒混勻后靜置3 min,再以1 500 r/min離心2 min,棄上清后用PBS重懸,制備成單細胞懸液(1×1010/L)。采用APC抗小鼠mouse CD11b抗體和PE抗小鼠iNOS抗體、Alexa Fluor 700抗小鼠CD206抗體進行胞外染色。采用Beckman CytoFLEX檢測細胞iNOS和CD206染色情況,通過FlowJo V10軟件分析巨噬細胞分化情況。

1.3.6流式細胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟組織中Th和CTL水平 治療結(jié)束后第7天,每組小鼠隨機取出3只,麻醉脫頸處死后剖離脾臟,于PBS中用研磨棒研磨,1 500 r/min離心2 min,棄上清液后加入紅細胞裂解液,顛倒混勻靜置3 min,再1 500 r/min離心2 min,棄上清后用含體積分數(shù)0.10胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸,制備成單細胞懸液(約1×1010個細胞/L)。脾細胞懸液置于含體積分數(shù)0.10胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,加10 000 μg/L的B16F10抗原、1 000 μg/L的BFA,于37 ℃下常規(guī)培養(yǎng)6 h。收集細胞,采用PB450抗鼠CD3抗體和FITC抗小鼠CD8a抗體4 ℃下染色30 min,于40 g/L多聚甲醛中室溫固定8 min。PBS洗滌后,以0.2%的Triton X-100 4 ℃下孵育30 min,分別用PE抗小鼠IFN-γ和PE抗小鼠TNF-ɑ染色CD3+T細胞和CD8+T細胞。使用Beckman CytoFLEX檢測細胞IFN-γ和TNF-α染色情況,使用FlowJo V10軟件分析各組小鼠脾細胞Th和CTL水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 PDA的表征及對RAW264.7細胞活力的影響

SEM觀察顯示,合成的PDA為球形顆粒,直徑均<1 μm(圖1A),有較強的吸附能力;接觸角測定顯示其為銳角(圖1B),表示合成的PDA具有親水性。Control組、LPS組、PDA′組RAW264.7細胞的細胞活力分別為1.34±0.15、0.52±0.08、1.51±0.15,組間比較差異有顯著性(F=48.21,P<0.05),其中LPS組與Control組、PDA′組比較差異均有顯著性(t=7.58、9.20,P<0.05)。

A:SEM顯示結(jié)果,30 000倍,B:PDA涂層的接觸角

2.2 LUT對RAW264.7細胞分化的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,Control組、IL-4組、IL-4+LUT組RAW264.7細胞CD206的表達水平分別為3 655.00±92.77、7 329.00±1 108.00、3 732.00±233.10。單因素方差分析結(jié)果顯示,各組間比較差異有顯著意義(F=30.72,P<0.05),其中IL-4組與IL-4+LUT組、Control組比較差異有顯著性(t=6.72、6.86,P<0.0.5)。

Control組、LPS組、LPS+LUT組中iNOS的表達水平分別為798.70±31.53、3 583.00±84.79、4 607.00±122.00。各組間比較差異有顯著性(F=1 516.00,P<0.05),三組間兩兩比較差異均有顯著性(t=14.31～53.21,P<0.05)。

2.3 各組小鼠腫瘤大小的比較

PDA組和PDA+LUT組小鼠經(jīng)紅外線儀照射后,熱成像儀觀察到腫瘤部位呈現(xiàn)紅色,模型組和LUT組小鼠腫瘤部位無變化(圖2)。治療結(jié)束后第2天,模型組、PDA組、LUT組以及PDA+LUT組的腫瘤面積分別為(171.30±10.52)、 (100.50±11.24)、(88.28±7.08)、(39.20±3.07)mm2。兩因素析因設(shè)計方差分析顯示,PDA、LUT及PDA與LUT交互作用均對腫瘤面積具有顯著影響(FPDA=242.30,FLUT=350.65,FPDA*LUT=7.95,P<0.05)。單獨效應(yīng)分析顯示,對小鼠注射或不注射PDA時,則注射或者不注射LUT對腫瘤面積均有顯著影響(F=126.52、23.10,P<0.05);對小鼠注射或不注射LUT時,則注射或不注射PDA對腫瘤面積均有顯著影響(F=81.24、169.00,P<0.05)。

圖2 各組小鼠治療前后熱成像儀觀察到的腫瘤圖像

2.4 各組小鼠生存率比較

治療結(jié)束后第14天小鼠存活率的Mantel-Cox檢驗顯示,PDA+LUT組與其他3組比較差異均有顯著性(χ2=9.70,P<0.05),見圖3。

圖3 各組建模小鼠生存曲線

2.5 PDA并LUT治療對各組小鼠脾臟巨噬細胞分化的影響

兩因素析因設(shè)計方差分析顯示,PDA、LUT以及PDA與LUT交互作用對iNOS和CD206的表達水平均具有顯著性影響(FPDA=200.90、220.01,FLUT=283.83、272.34,FPDA*LUT=27.90、27.04,P<0.05)。單獨效應(yīng)分析顯示,對小鼠注射或者不注射PDA,則注射或不注射LUT對iNOS和CD206表達水平均具有顯著影響(F=63.87～235.52,P<0.05);對小鼠注射或不注射LUT時,則注射或不注射PDA對iNOS和CD206表達水平均有顯著影響(F=39.54～200.67,P<0.05),見表1。

2.6 PDA并LUT對小鼠體內(nèi)CTL腫瘤殺傷功能的影響

兩因素析因設(shè)計的方差分析顯示,PDA、LUT以及PDA與LUT交互作用均對IFN-γ+CD4+和TNF-α+CD8+細胞比例均具有顯著性影響(FPDA=59.48、65.78,FLUT=181.38、176.54,FPDA*LUT=6.00、15.00,P<0.05)。單獨效應(yīng)分析結(jié)果顯示,對小鼠注射或不注射PDA,則注射或不注射LUT對IFN-γ+CD4+和TNF-α+CD8+細胞比例均有顯著影響(F=44.31～147.23,P<0.05);對小鼠注射或不注射LUT時,則注射或不注射PDA對IFN-γ+CD4+和TNF-α+CD8+細胞比例均具有顯著的影響(F=8.98～71.80,P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠脾臟巨噬細胞標志熒光強度和T細胞標記陽性細胞百分率比較

3 討 論

腫瘤免疫逃逸是指腫瘤細胞通過各種機制逃避免疫系統(tǒng)的識別和攻擊,是腫瘤生存和發(fā)展的重要原因[11]。抑制腫瘤細胞的免疫耐受,激活人體自身的抗腫瘤免疫功能,一直是腫瘤治療的研究方向和熱點[12-13]。而傳統(tǒng)治療方法如化療、放療等,毒副作用大,患者難以耐受[14],因此需要尋找更安全有效的抗腫瘤療法。

研究表明,激活A(yù)PC細胞是抑制腫瘤免疫耐受的關(guān)鍵[15],因為APC細胞在體內(nèi)的一個重要功能是促進抗原特異性免疫應(yīng)答,是激活特異性殺傷腫瘤細胞功能的關(guān)鍵起始點[16]。在先前的研究中已經(jīng)證實,LUT可以促進體外巨噬細胞向M1方向極化[9]。巨噬細胞在調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用[17-18],其中M1巨噬細胞抑制腫瘤生長,而M2巨噬細胞促進腫瘤生長,使M2巨噬細胞復(fù)極化為M1巨噬細胞或者抑制M2巨噬細胞生成是治療實體瘤的經(jīng)典理論[19]。

光熱治療作為近年來新興的腫瘤治療手段,與傳統(tǒng)手術(shù)切除腫瘤相比,雖然在治療位置上具有局限性,但在抑制腫瘤細胞生長同時,會有大量腫瘤相關(guān)抗原(TSA)和腫瘤特異性抗原(TAA)的釋放,可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗腫瘤的主動免疫應(yīng)答[20-22]。此外,PDA經(jīng)近紅外照射后產(chǎn)生的熱能還有調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境和激活荷瘤小鼠免疫反應(yīng)的作用[23]。PDA作為生物材料已被廣泛應(yīng)用[24-26],具有清除自由基、屏蔽紫外線、光熱轉(zhuǎn)化等功能[27]。本研究使用鹽酸多巴胺合成PDA,SEM下顯示其球形顆粒直徑<1 μm,說明其吸附能力較強;通過接觸角測定儀測定接觸角,顯示接觸角為銳角,說明本研究合成的PDA具有親水性;CCK-8實驗檢測結(jié)果顯示PDA′組對于細胞活性沒有影響,提示本研究合成的PDA生物相容性良好。

本研究以流式細胞術(shù)檢測LUT對RAW264.7細胞分化的影響,結(jié)果顯示LUT+IL-4組與IL-4組相比,M2標志因子CD206表達水平明顯下調(diào),LUT+LPS組與LPS組相比,M1標志因子iNOS表達水平明顯上調(diào),提示在RAW264.7細胞系中LUT可以抑制M2的極化,并促進M1極化。本研究又通過構(gòu)建黑色素瘤小鼠模型,驗證LUT是否可以抑制M2極化并促進M1的極化,研究結(jié)果顯示,PDA+LUT組小鼠脾臟中iNOS表達水平明顯上調(diào),而CD206表達水平明顯下調(diào),再次說明PDA聯(lián)合LUT治療將會抑制小鼠體內(nèi)巨噬細胞向M2極化。

本研究構(gòu)建了黑色素瘤小鼠模型,發(fā)現(xiàn)不注射PDA的模型小鼠經(jīng)過近紅外線照射后,并不能在腫瘤部位聚集熱能,而注射PDA的模型小鼠經(jīng)過近紅外線照射后,可在腫瘤部位聚集熱能,從而起到殺滅腫瘤的作用。同時PDA+LUT組小鼠腫瘤生長速度與其他組比較顯著減緩,并且其生存率與其他組比較顯著延長,說明PDA并LUT治療后會抑制小鼠腫瘤生長并提高生存率,提示光熱治療后腫瘤部位會有大量抗原釋放,與LUT共同作用下激活機體抗腫瘤免疫,起到抑制腫瘤生長的作用。巨噬細胞的M2極化是產(chǎn)生腫瘤免疫耐受的重要因素之一[28-29],為了進一步證明打破M2免疫耐受的微環(huán)境后,CTL是否被激活,本研究又通過流式細胞術(shù)檢測治療結(jié)束后第7天時小鼠脾臟組織,結(jié)果顯示PDA+LUT組小鼠脾臟中CD4+IFN-γ+細胞比例與其他組比較顯著上調(diào),說明小鼠脾臟中Th1細胞增多。本研究同樣以流式細胞術(shù)檢測了治療結(jié)束后第7天小鼠脾臟組織中CD8+TNF-α+細胞的比例,發(fā)現(xiàn)PDA+LUT組與其他組的CD8+TNF+細胞比例比較顯著上調(diào),大量的殺傷相關(guān)細胞因子的產(chǎn)生,也預(yù)示著PDA+LUT組存在著較多被激活的CD8+T細胞,并且有著較為強大的殺傷功能[30],因此在PDA并LUT治療促進巨噬細胞M1極化后,增強Th1以及CTL的功能,最終激活了機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示PDA并LUT聯(lián)合治療黑色素瘤模型小鼠以后,會誘導(dǎo)小鼠機體產(chǎn)生抗腫瘤的主動免疫應(yīng)答,從而抑制巨噬細胞M2極化并且促進其向M1極化,增加小鼠脾臟組織內(nèi)的CD4+IFN-γ+和CD8+TNF-α+細胞比例,其抗腫瘤免疫作用可能是通過激活Th1-CTL發(fā)揮作用的。本研究為小鼠實體瘤消除后釋放抗原激活機體免疫能力機制的研究提供了實驗依據(jù),也為抗腫瘤治療提供了新思路。

倫理批準和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會的審核批準(文件號QDUAEC2022493)。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》的規(guī)定進行。

作者聲明：李程琳、李玲、王梓聿、曹丁元、國超凡參與了研究設(shè)計;李程琳、王爽、李玲參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。