趙梓吟 何明陽 韓冰 關(guān)鴿 蔡金貞 張斌

(青島大學附屬醫(yī)院,山東 青島 266100 1 器官移植中心; 2 肝膽胰外科)

全球范圍內(nèi)肝癌的發(fā)病率及死亡率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢,其中肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的肝癌類型,其發(fā)病率約占原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的75%,確診以后5年的生存率僅約為18%[1-2]。盡管手術(shù)切除、射頻消融和經(jīng)動脈化療栓塞等治療方案改善了無轉(zhuǎn)移HCC患者的預后,但多數(shù)HCC患者確診時已經(jīng)是中晚期,對于無法手術(shù)的中晚期HCC患者,往往只能采取保守方案治療[3]。目前治療HCC的一線藥物包括阿替利珠單抗+貝伐珠單抗、多納非尼、侖伐替尼、索拉菲尼等,其中侖伐替尼作為多靶點的酪氨酸激酶抑制劑,適用于不可切除的肝功能為Child-Pugh A級的晚期HCC患者[4-6]。

近年來,對于腫瘤發(fā)展機制和治療方法的研究探索重心逐漸從腫瘤本身轉(zhuǎn)向其所處的腫瘤微環(huán)境(TME)[7-8],TME中基質(zhì)細胞具有遺傳穩(wěn)定性,可有效降低腫瘤耐藥和復發(fā)風險[9-11]。腫瘤相關(guān)成纖維細胞(CAFs)是激活的成纖維細胞,作為TME中最主要的基質(zhì)細胞成分以及細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵來源[12],CAFs在促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移中有關(guān)鍵作用,目前已經(jīng)成為潛在腫瘤治療靶點[13-15]。研究發(fā)現(xiàn),侖伐替尼可通過作用于腫瘤的多個靶點達到抑癌的作用,比如可靶向阻斷腫瘤的血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)途徑抑制腫瘤血管生成,可通過使腫瘤細胞饑餓和缺氧抑制腫瘤細胞生長致死亡,但侖伐替尼能否影響CAFs的生物學行為尚無相關(guān)研究報道。本研究擬探究侖伐替尼對CAFs生物學功能的影響及其機制,旨在為HCC患者的個性化治療提供理論依據(jù),同時為靶向TME的治療方式提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集于青島大學附屬醫(yī)院肝膽胰外科確診為HCC的3例患者的腫瘤組織以及癌旁正常組織標本用于原代CAFs分離培養(yǎng)。膠原酶、青鏈霉素購買于美國 Sigma公司;α-SMA抗體購買于美國cst公司,侖伐替尼購買于美國MCE公司;NEBNext UltraTM RNA文庫準備試劑盒購于美國Illumina公司。JEM-1200EX透射電鏡購于日本JEOL公司,超薄切片機購買于美國Ultracute公司,光學顯微鏡購于日本尼康公司。

1.2 CAFs的分離、純化、培養(yǎng)及分組

取3例患者的癌組織以及癌旁正常組織,用含10 g/L青鏈霉素的PBS溶液4 ℃下清洗2次,剪碎組織后,置于10 mL含體積分數(shù)0.10胎牛血清以及體積分數(shù)0.001的Ⅳ型膠原酶溶液中,37 ℃下恒溫搖床中消化30 min。將消化液用200目濾網(wǎng)過濾,670 r/min離心5 min,棄上清液后再漂洗2次,使用紅細胞裂解液去除紅細胞后,置于完全培養(yǎng)基(含體積分數(shù)0.10的胎牛血清及10 g/L青鏈霉素的DMEM高糖型培養(yǎng)基)中繼續(xù)培養(yǎng),3 d后更換新的完全培養(yǎng)基。在含有100 μg/L堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的完全培養(yǎng)基中采用自然傳代法對CAFs進行純化,獲得原代CAFs細胞。再將原代CAFs細胞重新培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待CAFs傳代3次且細胞融合度達80%～90%時,分別于培養(yǎng)基中加入46 nmol/L的侖伐替尼和等體積的DMSO,分為侖伐替尼組和DMSO組,繼續(xù)培養(yǎng)72 h用于后續(xù)實驗。

1.3 CAFs的免疫熒光檢測

將培養(yǎng)72 h的DMSO組和侖伐替尼組CAFs接種于鋪有細胞爬片的24孔板中,在37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,PBS清洗3次,40 g/L多聚甲醛固定30 min。再以PBS配置的體積分數(shù)0.003的曲拉通溶液常溫滲透15 min,PBS配置的體積分數(shù)0.05山羊血清常溫封閉1 h,α-SMA一抗孵育過夜后,加入FITC二抗室溫孵育2 h,DAPI復染7 min,PBS清洗后滴加甘油封片。使用激光共聚焦顯微鏡拍照并觀察兩組細胞中的α-SMA熒光強度。

1.4 CAFs的轉(zhuǎn)錄組學測序及富集分析

委托上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司對培養(yǎng)72 h的DMSO組和侖伐替尼組的CAFs進行轉(zhuǎn)錄組學測序,每組設(shè)3個重復樣本。根據(jù)基因表達分析結(jié)果篩選兩組間差異表達的基因(P<0.05),并對差異表達基因進行GO功能富集分析(http://geneontology.org)以及KEGG信號通路富集分析(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)。

1.5 侖伐替尼在CAFs上的藥物靶點組學測序及富集分析

委托上海中科新生命生物科技有限公司對培養(yǎng)72 h的DMSO組和侖伐替尼組的CAFs進行藥物靶點組學測序。通過質(zhì)譜分析對肽段酶切產(chǎn)物進行序列鑒定和數(shù)據(jù)非依賴性采集(DIA)蛋白質(zhì)組學定量分析,確定侖伐替尼在CAFs上結(jié)合的靶蛋白及序列,并對靶蛋白進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。

1.6 CAFs的透射電鏡掃描

將培養(yǎng)72 h的DMSO組和侖伐替尼組CAFs接種于鋪有細胞爬片的24孔板中,在37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后4 ℃下以體積分數(shù)0.025的戊二醛固定4 h。用PBS緩沖液沖洗細胞3次,每次10 min,再用4 ℃體積分數(shù)為0.01的鋨酸固定細胞2 h,用PBS緩沖液沖洗3次,每次10 min。用體積分數(shù)0.3、0.5、0.7、0.8、1.0的梯度乙醇對兩組細胞依次脫水,每次10 min。之后Epon812環(huán)氧樹脂包埋樣本,依次以37、45、65 ℃溫箱固化,每級溫度下24 h。半薄切片定位后用超薄切片機切片,醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色,最后使用透射電鏡觀察。

1.7 CAFs的Transwell實驗

將培養(yǎng)72 h后的DMSO組和侖伐替尼組的CAFs更換為無血清DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,接種于無血清DMEM培養(yǎng)基的Transwell上室(8 μm/孔)中,在37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,室溫下對遷移至下室的細胞用0.5%結(jié)晶紫染色20 min。使用光學顯微鏡對染色細胞進行拍照,對遷移CAFs進行計數(shù)。

1.8 CAFs劃痕實驗

將培養(yǎng)72 h的DMSO組和侖伐替尼組的細胞平鋪在6孔板中,待CAFs融合度達90%以上時,使用200 μL濾芯吸頭尖端在6孔板上劃痕。劃痕后將原培養(yǎng)基立即更換為含體積分數(shù)0.02胎牛血清的低血清培養(yǎng)基,用電子顯微鏡拍攝劃痕區(qū)域,分別于劃痕后0、24 h時采集圖像,并計算傷口愈合百分比,計算公式為:傷口愈合百分比=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 CAFs轉(zhuǎn)錄組學的測序結(jié)果及其GO功能及KEGG信號通路富集分析結(jié)果

免疫熒光染色結(jié)果顯示,CAFs標志物α-SMA染色陽性率>90%(圖1),圖中紅色為α-SMA染色的CAFs,藍色為DAPI染色的細胞核,提示分離培養(yǎng)培養(yǎng)成功,可用于后續(xù)實驗。轉(zhuǎn)錄組學測序結(jié)果示,與DMSO組進行比較,侖伐替尼組CAFs共有2 054個基因顯著上調(diào),2 109個基因顯著下調(diào)(P<0.05);GO功能富集分析顯示,差異基因與細胞遷移調(diào)節(jié)、成纖維細胞遷移、自噬體、溶酶體等功能密切相關(guān);KEGG信號通路富集分析顯示,差異基因參與的通路主要有溶酶體相關(guān)通路、PI3K-AKT通路、動物自噬相關(guān)通路、癌癥相關(guān)通路、肝細胞癌相關(guān)通路等。

2.2 CAFs藥物靶點組學的測序結(jié)果及其富集分析

對CAFs藥物靶點組學測序結(jié)果中篩選出的P<0.05的差異肽段進行GO功能及KEGG信號通路富集分析,顯示顯著富集的差異肽段與細胞遷移、細胞動力、細胞骨架、溶酶體等相關(guān),差異基因參與的通路主要有細胞骨架調(diào)節(jié)、肝細胞癌、細胞凋亡、PI3K-AKT通路、癌癥相關(guān)通路等。

2.3 侖伐替尼對CAFs自噬及遷移的影響

透射電鏡掃描結(jié)果顯示,DMSO組和侖伐替尼組CAFs中自噬小體(黃色箭頭所示)數(shù)目分別為2.00±1.00、7.67±1.53,兩組相比較差異顯著(t=5.38,P<0.05),見圖2。Transwell實驗結(jié)果顯示,DMSO組和侖伐替尼組中CAFs遷移數(shù)目分別為60.00±5.00、26.67±2.52,兩組比較差異有顯著性(t=10.31,P<0.05),見圖3。劃痕實驗結(jié)果顯示,DMSO組和侖伐替尼組遷移的CAFs傷口愈合百分比分別為58.00±4.00、21.00±2.00,兩組比較差異有顯著性(t=14.33,P<0.05)。

A:DMSO組,B:侖伐替尼組;結(jié)晶紫染色,10倍

3 討 論

HCC的高復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率導致HCC患者的長期存活率不理想[1-2]。因此,進一步探究肝癌的轉(zhuǎn)移機制及探究新的治療策略,對于延長肝癌患者生存時間至關(guān)重要[16-17]。肝癌的轉(zhuǎn)移不僅需要肝癌細胞逃避凋亡信號及宿主免疫反應(yīng),還需要TME中細胞間通訊支持,因此目前對于腫瘤發(fā)病機制和治療方法的探索重心也逐漸從腫瘤本身轉(zhuǎn)向其所處微環(huán)境,靶向TME的治療方式被寄予厚望,主要有以下幾方面原因:腫瘤微環(huán)境中的其他細胞具有遺傳穩(wěn)定性,比易發(fā)生基因突變的腫瘤細胞更容易靶向治療尋找靶點[18];不同于腫瘤細胞的獲得性耐藥,靶向腫瘤微環(huán)境的治療可有效減少耐藥風險和腫瘤復發(fā)。

CAFs是激活的成纖維細胞,是TME中最主要的基質(zhì)細胞成分以及細胞外基質(zhì)(ECM)的關(guān)鍵來源,在促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵作用,并且也是潛在的腫瘤治療靶點。目前,針對靶向CAFs的治療策略研究主要集中為以下3個方面:通過靶向特異性表面標志物(如成纖維細胞活化蛋白FAP)去除CAFs、靶向CAF的下游效應(yīng)器和信號通路、將促腫瘤性CAF的激活狀態(tài)恢復為相對靜止狀態(tài)或腫瘤抑制型。

侖伐替尼可以通過靶向阻斷VEGFR2途徑抑制腫瘤血管生成,使腫瘤細胞饑餓和缺氧,從而導致其嚴重生長遲緩甚至死亡。侖伐替尼還可以作用于HCC本身及其TME內(nèi)多種細胞的多個靶點[19]。目前侖伐替尼對肝癌細胞的直接作用機制研究較為成熟,但尚未見侖伐替尼對CAFs的生物學行為影響的研究。

為探索侖伐替尼對CAFs生物學行為的影響,本研究首先分離培養(yǎng)了原代CAFs,通過免疫熒光染色的方法鑒定CAFs的標志物,即平滑肌肌動蛋白α-SMA,結(jié)果顯示,本研究培養(yǎng)的原代CAFs中α-SMA免疫熒光染色陽性率>90%,可以用于后續(xù)細胞實驗。

通過轉(zhuǎn)錄組學測序和藥物靶點組學測序,本研究發(fā)現(xiàn)DMSO組和侖伐替尼組的CAFs之間的差異基因和差異肽段主要富集在細胞遷移、自噬等相關(guān)功能和通路上,提示侖伐替尼可能主要通過影響CAFs的自噬以及遷移的能力,進一步影響HCC的進展。自噬是一種細胞組分被運送到溶酶體進行降解的過程,以保持細胞成分的基礎(chǔ)周轉(zhuǎn),同時提供能量和大分子前體[20]。到目前為止,關(guān)于自噬在腫瘤進展和抑制中的雙重作用仍然存在著爭議,自噬在腫瘤發(fā)展的不同階段中起著動態(tài)的促癌或者抑癌的作用[21]。對自噬的調(diào)控可以作為腫瘤治療的有效介入策略。本研究結(jié)果顯示侖伐替尼與CAFs自噬相關(guān),并且可能通過這一途徑抑制了CAFs的促癌作用。

本研究同時通過透射電鏡觀察CAFs,以驗證侖伐替尼對CAFs自噬的誘導作用,transwell和細胞劃痕實驗結(jié)果均顯示,侖伐替尼對CAFs遷移具有抑制作用。根據(jù)已有研究報道,CAFs可通過化學途徑調(diào)節(jié)血管生成、基質(zhì)重塑,分泌能促進腫瘤生長和抑制腫瘤免疫的細胞因子、趨化因子、炎癥因子和生長因子,并促進腫瘤細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和干細胞特性(CSCs),從而促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[22-24]。除此之外,CAFs還可以通過機械力的作用,以物理方式對腫瘤起到協(xié)同轉(zhuǎn)移作用[25]。結(jié)合本研究的結(jié)果,提示侖伐替尼除了直接作用于腫瘤細胞外,也可以通過作用于CAFs間接抑制腫瘤進展。

綜上所述,本研究首次對于侖伐替尼處理過的CAFs進行轉(zhuǎn)錄組學測序和藥物靶點組學測序,首次發(fā)現(xiàn)了侖伐替尼可誘導CAFs自噬,并抑制其遷移。本研究不僅驗證了靶向藥物侖伐替尼除了對腫瘤細胞本身的作用之外,而其對TME的作用也為CAFs靶向治療提供了新思路。未來應(yīng)進一步探索CAFs的特異性靶點及作用機制,為HCC的治療探索新的方向。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的審核批準(文件號QYFYWZLL27592)。所有試驗過程均遵照《赫爾辛基宣言》(1996版)和中國有關(guān)臨床試驗研究規(guī)范、法規(guī)進行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

作者聲明：趙梓吟、張斌、韓冰參與了研究設(shè)計;趙梓吟、何明陽、關(guān)鴿、蔡金貞參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。