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        菜心群體中AUF2 基因的遺傳變異及其與農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

        2023-06-07 03:44:30黃依琳許玉富李榮華李光光郭培國夏巖石
        廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年4期

        黃依琳,許玉富,李榮華,李光光,張 華,郭培國,夏巖石

        (1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院作物抗逆國際合作研究中心,廣東 廣州 510006;2.廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,廣東 廣州 510308)

        【研究意義】菜心(Brassica campestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee)是十字花科蕓薹屬白菜亞種中以花薹為產(chǎn)品的一個(gè)變種,營養(yǎng)價(jià)值高,風(fēng)味獨(dú)特,已經(jīng)成為華南地區(qū)人們?nèi)粘o嬍持斜夭豢缮俚氖卟朔N類[1]。隨著消費(fèi)者對(duì)其品質(zhì)要求的提高,選育性狀優(yōu)良的菜心品種已成為當(dāng)前主要的研究方向。通過分析候選基因的自然變異對(duì)菜心生長發(fā)育的影響,挖掘其優(yōu)異等位基因,可為菜心分子輔助育種提供理論參考,加快優(yōu)良菜心品種的選育?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】Auxin Up-regulated F-box protein(AUF)基因是一類生長素上調(diào)的F-box 蛋白基因,在陸生植物中廣泛分布,包含AUF1和AUF2兩個(gè)同源基因,研究顯示其通過調(diào)控生長素與細(xì)胞分裂素在根的分布而促進(jìn)擬南芥根系的延長[2]。F-box 蛋白家族是一類含有F-box 基序(motif),在泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解過程中具有底物識(shí)別特性的蛋白質(zhì),參與植物的生長發(fā)育過程和激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,也在植物的逆境和防御反應(yīng)中發(fā)揮重要功能[3]。Rameneni 等[4]在大白菜的蛋白數(shù)據(jù)庫中鑒定出571 個(gè)F-box 蛋白基因,其中69 個(gè)基因在非生物脅迫條件(寒冷、干旱和鹽脅迫)下差異表達(dá),446 個(gè)基因在特定組織(愈傷組織、根、葉、莖、花和角果)中表達(dá)。在油菜[5-6]和芥蘭[7]研究中,也證實(shí)F-box 蛋白基因與作物的抗病、抗鹽脅迫、器官生長和花期等性狀存在顯著的相關(guān)性。Ikram等[8]通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),高溫脅迫后菜心葉片中有27 個(gè)F-box 蛋白基因表達(dá)水平差異顯著,其中AUF2基因表現(xiàn)出顯著的下調(diào),其可能對(duì)菜心的高溫脅迫產(chǎn)生響應(yīng)。目前,關(guān)于AUF2基因在菜心生長發(fā)育過程中的生物學(xué)功能未見詳細(xì)的報(bào)道?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】檢測(cè)候選基因在自然群體中具有多態(tài)性,通過關(guān)聯(lián)分析有助于闡釋相關(guān)基因的生物學(xué)功能,挖掘其優(yōu)異等位基因可應(yīng)用于作物的遺傳育種[9]。Mao 等[10]對(duì)262 份玉米自交系材料中的ZmNAC111基因進(jìn)行測(cè)序和關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)一個(gè)長度為82 bp 的InDel 與種子存活率顯著相關(guān),表型解釋率為7.27%;唐婧泉等[11]檢測(cè)了SnRK基因家族在530 份油菜材料的多態(tài)性,發(fā)現(xiàn)14 個(gè)SNP 位點(diǎn)與種子含油量顯著關(guān)聯(lián),表型解釋率最高達(dá)到12.95%,構(gòu)成的優(yōu)異單倍型材料種子含油量平均達(dá)42%;許德蓉等[12]在110 份馬鈴薯材料中檢測(cè)到StDRO1基因的6 個(gè)SNP 與馬鈴薯根系性狀顯著關(guān)聯(lián),構(gòu)成的優(yōu)異單倍型根系性狀與其他單倍型的差異更顯著。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用156 份菜心種質(zhì)材料構(gòu)建自然群體,通過PCR 擴(kuò)增和直接測(cè)序,分析AUF2基因在自然群體中變異位點(diǎn),然后與菜心的農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,確定AUF2基因在菜心生長發(fā)育中的生物功能,挖掘AUF2的優(yōu)異等位位點(diǎn)和單倍型,為菜心品種的分子輔助選育提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        本研究選用156 份菜心種質(zhì)材料構(gòu)建自然群體,其中黃綠葉色的材料16 份、深綠葉色的材料83 份和油綠葉色的材料57 份,均來源于廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,部分材料為全國不同地方的商用品種,其余材料為廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院在全國范圍內(nèi)收集的野生種并自行編號(hào)(表1)。

        表1 供試156 份菜心種質(zhì)材料—覽表Table 1 List of 156 flowering Chinese cabbage accessions used in this study

        所有菜心種質(zhì)材料于2020 年11 月26 日在廣州大學(xué)作物抗逆國際合作研究中心的試驗(yàn)基地進(jìn)行種植,采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),每個(gè)品種單獨(dú)編號(hào),均勻播種在0.5 m2的種植區(qū)域,常規(guī)水肥管理和病蟲害防治,待生長至齊口花采收期。參考前人方法[13-15],每個(gè)種質(zhì)材料避開邊行,選取代表性的5 株植株,對(duì)株高、單株質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬、最大葉柄長和葉綠素含量(SPAD 值)等6 個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行測(cè)定,其中株高和單株質(zhì)量是菜心優(yōu)異品種選擇的主要指標(biāo)[14],而最大葉長、最大葉寬、最大柄長和葉綠素含量(SPAD 值)能代表菜心外觀品質(zhì)的大部分性狀[15]。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1AUF2基因的擴(kuò)增及測(cè)序 取菜心的新鮮嫩葉,利用植物基因組DNA 提取試劑盒提取菜心的DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳和SmartSpec plus核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)所提取DNA 的質(zhì)量和濃度,檢測(cè)合格的DNA 樣品稀釋成10 ng/μL 作為后續(xù)P CR 擴(kuò)增的模板。參考Brassica napus(rapa)的AUF2基因序列(XM_013866655.3),利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)3 對(duì)具有重疊區(qū)域的特異性引物(表2、圖1),擴(kuò)增156 份菜心種質(zhì)材料的AUF2基因序列,瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性,做好相關(guān)標(biāo)記后送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行PCR 產(chǎn)物雙向測(cè)序。

        圖1 AUF2 基因的多態(tài)性位點(diǎn)及PCR 擴(kuò)增區(qū)域Fig.1 Distribution of polymorphism sites and PCR amplification region of AUF2 gene

        表2 克隆菜心AUF2 基因的引物序列Table 2 Primer sequences used to clone the AUF2 gene of flowering Chinese cabbage

        1.2.2 菜心群體中AUF2 基因的多態(tài)性分析 使用Mega 6.0 軟件[16]對(duì)初始測(cè)序結(jié)果進(jìn)行修剪后,拼接156 份菜心種質(zhì)材料的AUF2基因序列,然后與Brassica napus(rapa)的AUF2基因序列(XM_013866655.3)進(jìn)行序列比對(duì),利用Geneious 9.0.2 軟件[17]分析可能存在的SNP 等變異位點(diǎn)。核苷酸多樣性、單倍型多樣性、Tajima’s D 值、Fu and Li’s D*值及Fu and Li’s F*值等通過軟件Dnasp 6[18]進(jìn)行計(jì)算。

        1.2.3 AUF2 基因的多態(tài)性位點(diǎn)與菜心農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析 使用Tassel 5.0 軟件[19]的混合線性模型(Mixed liner model,MLM)對(duì)AUF2基因的多態(tài)性位點(diǎn)與菜心的6 個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,關(guān)聯(lián)分析所需群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系數(shù)據(jù)來自實(shí)驗(yàn)室前期分析成果[20],在P<0.01 水平上,統(tǒng)計(jì)多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)表型變異的貢獻(xiàn)率(R2)。參考王娟等[21]方法,計(jì)算等位變異的表型效應(yīng)值,獲得與表型性狀顯著關(guān)聯(lián)多態(tài)位點(diǎn)的優(yōu)異等位變異。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 菜心群體主要農(nóng)藝性狀的變異特征

        由表3 可知,菜心的株高、單株質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬、最大葉柄長和葉綠素含量(SPAD值)等6 個(gè)農(nóng)藝性狀在156 個(gè)菜心種質(zhì)材料間都存在明顯差異,變異豐富,變異系數(shù)在12.30%~ 77.03%之間,其中,葉綠素含量(SPAD 值)的變異系數(shù)最小,單株質(zhì)量的變異系數(shù)最大。6 個(gè)農(nóng)藝性狀的偏度值分別在1.20~ 4.80 之間,表明6 個(gè)農(nóng)藝性狀呈現(xiàn)明顯的右偏離,群體中低于平均值的菜心種質(zhì)材料較多,其中葉綠素含量(SPAD值)偏度值最小,而單株質(zhì)量的偏度值最大。

        表3 156 份菜心種質(zhì)材料農(nóng)藝性狀的變異特征Table 3 Variation characteristics of agronomic traits in 156 flowering Chinese cabbage accessions

        2.2 菜心群體中AUF2 基因的核苷酸多態(tài)性

        通過PCR 擴(kuò)增和測(cè)序分析,顯示AUF2基因在菜心自然群體中存在豐富的自然變異,在2 996 bp 的擴(kuò)增區(qū)內(nèi)共鑒定出34 個(gè)變異位點(diǎn),包含31個(gè)SNP和3個(gè)InDel,構(gòu)成36個(gè)單倍型(圖1、表4),其中31 個(gè)SNP 中堿基的轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)分別為23、8 個(gè),核苷酸多樣性(π)為0.00503,單倍型多樣性(Hd)為0.780。由表4 可知,上游非編碼區(qū)1 498 bp內(nèi)檢測(cè)到26個(gè)SNP和2個(gè)InDel(均缺失11 bp),構(gòu)成23 個(gè)單倍型,核苷酸多樣性(π)為0.00866,單倍型多樣性(Hd)為0.765;編碼區(qū)960 bp 內(nèi)檢測(cè)到5 個(gè)SNP(2 個(gè)SNP 為同義突變,3 個(gè)SNP 為非同義突變)和1 個(gè)InDel(缺失23 bp),構(gòu)成17 個(gè)單倍型,核苷酸多樣性(π)為0.00195,單倍型多樣性(Hd)為0.582;下游非編碼538 bp 范圍沒有檢測(cè)出變異位點(diǎn)。

        表4 菜心群體中AUF2 基因的序列變異參數(shù)Table 4 Parameters for the sequence variants of AUF2 gene in flowering Chinese cabbage population

        選用Tajima’s D、Fu and Li’s D*和Fu and Li’s F*等中性檢驗(yàn)評(píng)價(jià)基因是否受到選擇作用。在中性進(jìn)化模型下,這些統(tǒng)計(jì)值為零,當(dāng)統(tǒng)計(jì)值為負(fù)值通常是由于定向選擇引起,而當(dāng)統(tǒng)計(jì)值為正值時(shí)則由平衡選擇引起[22]。由表4 可知,AUF2基因在菜心自然群體中Tajima’s D 值為4.27790,在P<0.001 水平上顯著偏離中性選擇,表明其存在大量中等頻率的等位位點(diǎn),可能的原因是群體瓶頸效應(yīng)或平衡選擇;Fu and Li’s D*值和Fu and Li’s F*值分別為2.06339 和3.57745,在P<0.02水平上顯著偏離中性檢測(cè)。不同區(qū)段的中性檢驗(yàn)顯示,AUF2基因上游非編碼區(qū)顯著偏離中性選擇,但在編碼區(qū)偏離中性選擇不顯著。該結(jié)果說明,AUF2基因在菜心馴化過程中經(jīng)受了更大的選擇壓力,可能是選擇的靶標(biāo)候選基因。

        2.3 AUF2 基因的多態(tài)位點(diǎn)與菜心農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

        采用Tassel 5.0軟件中的混合線性模型(MLM)對(duì)AUF2基因的多態(tài)位點(diǎn)與菜心的株高、單株質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬、最大葉柄長和葉綠素含量(SPAD 值)等6 個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果顯示有4 個(gè)SNP 分別與單株質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬和最大葉柄長等4 個(gè)農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)(P<0.01),其對(duì)表型變異的解釋率在5.04%~6.52%之間,平均值為5.69%(表5)。其中SNP_1267 與單株質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬和最大葉柄長等4 個(gè)農(nóng)藝性狀都顯著相關(guān),對(duì)表型變異的解釋率分別為5.43%、6.42%、5.04%和6.52%,優(yōu)異等位變異為A 堿基,占檢測(cè)樣本的頻率為25.00%;SNP_1346、SNP_1461和SNP_1504 等3 個(gè)位點(diǎn)都與最大葉柄長顯著相關(guān),對(duì)表型變異的解釋率分別為5.30%、5.47%和5.66%,其優(yōu)異等位變異分別是C、C 和T 等堿基,占檢測(cè)樣本的頻率分別為26.28%、28.85%和25.64%。SNP_1267、SNP_1346 和SNP_1461 3 個(gè)變異位點(diǎn)位于5'端的非編碼區(qū),SNP_1504 為編碼區(qū)的非同義突變,導(dǎo)致其氨基酸由天冬氨酸突變?yōu)槔i氨酸。

        表5 與菜心農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP 位點(diǎn)Table 5 SNPs loci significantly associated with agronomic traits in flowering Chinese cabbage

        在156個(gè)菜心種質(zhì)中,SNP_1267、SNP_1346、SNP_1461 和SNP_1504 等4 個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SNP 位點(diǎn)構(gòu)成了7 個(gè)單倍型(表6),其中單倍型Hap1 由4 個(gè)最通常的堿基構(gòu)成,含110 個(gè)種質(zhì)材料,占總數(shù)的70.51%;單倍型Hap2 由4 個(gè)優(yōu)異等位變異構(gòu)成,含35 個(gè)種質(zhì)材料,占總數(shù)的22.44%;其余5 個(gè)單倍型為稀有單倍型,其占比均小于5%。與單倍型Hap1 相比,單倍型Hap2的單株質(zhì)量在P<0.05 水平上顯著增加,最大葉柄長在P<0.01 水平上極顯著提高,而株高、最大葉長、最大葉寬和葉綠素含量(SPAD 值)等4個(gè)農(nóng)藝性狀無顯著差異(表7)。

        表6 4 個(gè)顯著關(guān)聯(lián)SNP 位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型Table 6 Haplotypes formed by 4 significantly associated SNPs

        表7 2 個(gè)主要單倍型對(duì)菜心農(nóng)藝性狀的影響Table 7 Effects of two haplotypes on agronomic traits of flowering Chinese cabbage

        3 討論

        檢測(cè)候選基因內(nèi)的等位變異,有助于鑒定和分離遺傳多樣性材料中有價(jià)值的等位變異。本研究發(fā)現(xiàn)AUF2基因在156 份菜心種質(zhì)群體中存在豐富的自然變異,在2 996 bp 的擴(kuò)增區(qū)內(nèi)共檢測(cè)到34 個(gè)變異位點(diǎn),其中26 個(gè)SNP 和2 個(gè)InDel分布在上游非編碼區(qū),5 個(gè)SNP 和1 個(gè)InDel 分布在編碼區(qū)。前人研究證實(shí),基因內(nèi)的不同區(qū)域SNP 頻率不同,如編碼區(qū)比非編碼區(qū)存在更少的SNP 和InDel[23-24]。AUF2基因在菜心群體在中的核苷酸多樣性為0.00503,這一結(jié)果略高于甲基化相關(guān)基因在白菜和芥藍(lán)群體中核苷酸多樣性(0.004558 和0.004352)[25],顯著高于β-CT亞基編碼基因accD在油菜群體中核苷酸多樣性(0.00009)[26],這可能與試驗(yàn)材料的多樣性相關(guān),也反映了基因變異的豐富程度。中性選擇性評(píng)價(jià)顯示AUF2基因的Tajima’s D 值、Fuand Li’s D*值和Fuand Li’s F*值均顯著偏離中性檢測(cè),其可能是群體瓶頸效應(yīng)或平衡選擇的結(jié)果,前人通過分子標(biāo)記[27-29]對(duì)菜心的多樣性分析也表明菜心種質(zhì)材料間的遺傳背景較窄,這可能由于菜心僅是白菜的一個(gè)變種,起源于我國華南地區(qū),栽培區(qū)域的局限及長期系統(tǒng)選育造成了種質(zhì)資源的親緣關(guān)系較近[29]。

        對(duì)AUF2基因的多態(tài)位點(diǎn)與菜心6 個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 個(gè)SNP 同時(shí)與單株質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬和最大葉柄長等4 個(gè)農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)(P<0.01),還有3 個(gè)SNP與最大葉柄長顯著關(guān)聯(lián)(P<0.01),4 個(gè)SNP 對(duì)表型變異的解釋率在5.04%~6.52%之間,平均值為5.69%,優(yōu)異等位位點(diǎn)的頻率達(dá)到25%以上,其中3 個(gè)SNP 位于5’端的非編碼區(qū),1 個(gè)SNP 為編碼區(qū)的非同義突變,導(dǎo)致酸性的天冬氨酸變?yōu)榉菢O性的纈氨酸,這種單一氨基酸的變化很容易破壞分子內(nèi)相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),影響蛋白質(zhì)的折疊方式、穩(wěn)定性、動(dòng)力學(xué),并最終影響蛋白質(zhì)的功能[30]。由4 個(gè)優(yōu)異等位變異構(gòu)成的單倍型Hap2 在P <0.01 水平上顯著提高最大葉柄長的長度,這可能是AUF2基因促進(jìn)了細(xì)胞分裂素介導(dǎo)的細(xì)胞在伸長和分化區(qū)擴(kuò)張的結(jié)果[2]。葉柄長是白菜類蔬菜的重要農(nóng)藝性狀,影響作物的種植密度和外觀品質(zhì)。繆體云等[31]研究顯示,結(jié)球甘藍(lán)的葉柄長由2 對(duì)主基因控制,其遺傳率高達(dá)90.44%。李威等[32]和章云[33]利用大白菜DH 群體均鑒定到2 個(gè)與葉柄長相關(guān)的QTL 位點(diǎn),解釋的遺傳貢獻(xiàn)率在6.29%~ 12.9%之間,劉洋[34]在構(gòu)建大白菜-菜心染色體片段替換系的基礎(chǔ)上,共檢測(cè)到8 個(gè)與葉柄長相關(guān)的QTL 位點(diǎn),加性效應(yīng)在37.32%~ 62.61%之間,他們都在連鎖群A08 上檢測(cè)到1 個(gè)QTL 位點(diǎn),這個(gè)QTL 位點(diǎn)可能與位于A08 染色體上的AUF2基因存在相互作用來調(diào)節(jié)白菜類蔬菜葉柄的長度,而關(guān)于AUF2基因調(diào)控葉柄長的分子機(jī)理還需進(jìn)一步的研究。

        4 結(jié)論

        AUF2基因在菜心群體中存在豐富的自然變異。在2 996 bp 的擴(kuò)增區(qū)內(nèi)共鑒定出34 個(gè)變異位點(diǎn),其中上游非編碼區(qū)1 498 bp 內(nèi)含26 個(gè)SNP和2 個(gè)InDel,編碼區(qū)960 bp 內(nèi)含5 個(gè)SNP 和1 個(gè)InDel,而下游非編碼區(qū)538 bp 范圍沒有檢測(cè)出變異位點(diǎn)。中性檢測(cè)顯示,AUF2基因在菜心自然群體中Tajima’s D 值、Fuand Li’s D*值和Fuand Li’s F*值均顯著偏離中性選擇,其可能是群體瓶頸效應(yīng)或平衡選擇的結(jié)果。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),4 個(gè)SNP 位點(diǎn)與菜心的單株質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬和最大葉柄長等4 個(gè)農(nóng)藝性狀呈顯著相關(guān)性(P<0.01),其表型解釋率在5.04%~ 6.52%范圍,4 個(gè)優(yōu)異等位變異構(gòu)成的單倍型Hap2 能顯著提高菜心的單株質(zhì)量和最大葉柄長。這些優(yōu)異等位變異和單倍型可為菜心品種的遺傳改良提供參考。

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