黃依琳，許玉富，李榮華，李光光，張 華，郭培國，夏巖石

（1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院作物抗逆國際合作研究中心，廣東 廣州 510006；2.廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510308）

【研究意義】菜心（Brassica campestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee）是十字花科蕓薹屬白菜亞種中以花薹為產(chǎn)品的一個(gè)變種，營養(yǎng)價(jià)值高，風(fēng)味獨(dú)特，已經(jīng)成為華南地區(qū)人們?nèi)粘ｏ嬍持斜夭豢缮俚氖卟朔N類［1］。隨著消費(fèi)者對(duì)其品質(zhì)要求的提高，選育性狀優(yōu)良的菜心品種已成為當(dāng)前主要的研究方向。通過分析候選基因的自然變異對(duì)菜心生長發(fā)育的影響，挖掘其優(yōu)異等位基因，可為菜心分子輔助育種提供理論參考，加快優(yōu)良菜心品種的選育?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Auxin Up-regulated F-box protein（AUF）基因是一類生長素上調(diào)的F-box 蛋白基因，在陸生植物中廣泛分布，包含AUF1和AUF2兩個(gè)同源基因，研究顯示其通過調(diào)控生長素與細(xì)胞分裂素在根的分布而促進(jìn)擬南芥根系的延長［2］。F-box 蛋白家族是一類含有F-box 基序（motif），在泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解過程中具有底物識(shí)別特性的蛋白質(zhì)，參與植物的生長發(fā)育過程和激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也在植物的逆境和防御反應(yīng)中發(fā)揮重要功能［3］。Rameneni 等［4］在大白菜的蛋白數(shù)據(jù)庫中鑒定出571 個(gè)F-box 蛋白基因，其中69 個(gè)基因在非生物脅迫條件（寒冷、干旱和鹽脅迫）下差異表達(dá)，446 個(gè)基因在特定組織（愈傷組織、根、葉、莖、花和角果）中表達(dá)。在油菜［5-6］和芥蘭［7］研究中，也證實(shí)F-box 蛋白基因與作物的抗病、抗鹽脅迫、器官生長和花期等性狀存在顯著的相關(guān)性。Ikram等［8］通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫后菜心葉片中有27 個(gè)F-box 蛋白基因表達(dá)水平差異顯著，其中AUF2基因表現(xiàn)出顯著的下調(diào)，其可能對(duì)菜心的高溫脅迫產(chǎn)生響應(yīng)。目前，關(guān)于AUF2基因在菜心生長發(fā)育過程中的生物學(xué)功能未見詳細(xì)的報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】檢測(cè)候選基因在自然群體中具有多態(tài)性，通過關(guān)聯(lián)分析有助于闡釋相關(guān)基因的生物學(xué)功能，挖掘其優(yōu)異等位基因可應(yīng)用于作物的遺傳育種［9］。Mao 等［10］對(duì)262 份玉米自交系材料中的ZmNAC111基因進(jìn)行測(cè)序和關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)長度為82 bp 的InDel 與種子存活率顯著相關(guān)，表型解釋率為7.27%；唐婧泉等［11］檢測(cè)了SnRK基因家族在530 份油菜材料的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)14 個(gè)SNP 位點(diǎn)與種子含油量顯著關(guān)聯(lián)，表型解釋率最高達(dá)到12.95%，構(gòu)成的優(yōu)異單倍型材料種子含油量平均達(dá)42%；許德蓉等［12］在110 份馬鈴薯材料中檢測(cè)到StDRO1基因的6 個(gè)SNP 與馬鈴薯根系性狀顯著關(guān)聯(lián)，構(gòu)成的優(yōu)異單倍型根系性狀與其他單倍型的差異更顯著。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用156 份菜心種質(zhì)材料構(gòu)建自然群體，通過PCR 擴(kuò)增和直接測(cè)序，分析AUF2基因在自然群體中變異位點(diǎn)，然后與菜心的農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，確定AUF2基因在菜心生長發(fā)育中的生物功能，挖掘AUF2的優(yōu)異等位位點(diǎn)和單倍型，為菜心品種的分子輔助選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用156 份菜心種質(zhì)材料構(gòu)建自然群體，其中黃綠葉色的材料16 份、深綠葉色的材料83 份和油綠葉色的材料57 份，均來源于廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，部分材料為全國不同地方的商用品種，其余材料為廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院在全國范圍內(nèi)收集的野生種并自行編號(hào)（表1）。

表1 供試156 份菜心種質(zhì)材料—覽表Table 1 List of 156 flowering Chinese cabbage accessions used in this study

所有菜心種質(zhì)材料于2020 年11 月26 日在廣州大學(xué)作物抗逆國際合作研究中心的試驗(yàn)基地進(jìn)行種植，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)品種單獨(dú)編號(hào)，均勻播種在0.5 m2的種植區(qū)域，常規(guī)水肥管理和病蟲害防治，待生長至齊口花采收期。參考前人方法［13-15］，每個(gè)種質(zhì)材料避開邊行，選取代表性的5 株植株，對(duì)株高、單株質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬、最大葉柄長和葉綠素含量（SPAD 值）等6 個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行測(cè)定，其中株高和單株質(zhì)量是菜心優(yōu)異品種選擇的主要指標(biāo)［14］，而最大葉長、最大葉寬、最大柄長和葉綠素含量（SPAD 值）能代表菜心外觀品質(zhì)的大部分性狀［15］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1AUF2基因的擴(kuò)增及測(cè)序 取菜心的新鮮嫩葉，利用植物基因組DNA 提取試劑盒提取菜心的DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和SmartSpec plus核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)所提取DNA 的質(zhì)量和濃度，檢測(cè)合格的DNA 樣品稀釋成10 ng/μL 作為后續(xù)P CR 擴(kuò)增的模板。參考Brassica napus（rapa）的AUF2基因序列（XM_013866655.3），利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)3 對(duì)具有重疊區(qū)域的特異性引物（表2、圖1），擴(kuò)增156 份菜心種質(zhì)材料的AUF2基因序列，瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，做好相關(guān)標(biāo)記后送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行PCR 產(chǎn)物雙向測(cè)序。

圖1 AUF2 基因的多態(tài)性位點(diǎn)及PCR 擴(kuò)增區(qū)域Fig.1 Distribution of polymorphism sites and PCR amplification region of AUF2 gene

表2 克隆菜心AUF2 基因的引物序列Table 2 Primer sequences used to clone the AUF2 gene of flowering Chinese cabbage

1.2.2 菜心群體中AUF2 基因的多態(tài)性分析 使用Mega 6.0 軟件［16］對(duì)初始測(cè)序結(jié)果進(jìn)行修剪后，拼接156 份菜心種質(zhì)材料的AUF2基因序列，然后與Brassica napus（rapa）的AUF2基因序列（XM_013866655.3）進(jìn)行序列比對(duì)，利用Geneious 9.0.2 軟件［17］分析可能存在的SNP 等變異位點(diǎn)。核苷酸多樣性、單倍型多樣性、Tajima’s D 值、Fu and Li’s D*值及Fu and Li’s F*值等通過軟件Dnasp 6［18］進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 AUF2 基因的多態(tài)性位點(diǎn)與菜心農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析 使用Tassel 5.0 軟件［19］的混合線性模型（Mixed liner model，MLM）對(duì)AUF2基因的多態(tài)性位點(diǎn)與菜心的6 個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，關(guān)聯(lián)分析所需群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系數(shù)據(jù)來自實(shí)驗(yàn)室前期分析成果［20］，在P<0.01 水平上，統(tǒng)計(jì)多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)表型變異的貢獻(xiàn)率（R2）。參考王娟等［21］方法，計(jì)算等位變異的表型效應(yīng)值，獲得與表型性狀顯著關(guān)聯(lián)多態(tài)位點(diǎn)的優(yōu)異等位變異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜心群體主要農(nóng)藝性狀的變異特征

由表3 可知，菜心的株高、單株質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬、最大葉柄長和葉綠素含量（SPAD值）等6 個(gè)農(nóng)藝性狀在156 個(gè)菜心種質(zhì)材料間都存在明顯差異，變異豐富，變異系數(shù)在12.30%～ 77.03%之間，其中，葉綠素含量（SPAD 值）的變異系數(shù)最小，單株質(zhì)量的變異系數(shù)最大。6 個(gè)農(nóng)藝性狀的偏度值分別在1.20～ 4.80 之間，表明6 個(gè)農(nóng)藝性狀呈現(xiàn)明顯的右偏離，群體中低于平均值的菜心種質(zhì)材料較多，其中葉綠素含量（SPAD值）偏度值最小，而單株質(zhì)量的偏度值最大。

表3 156 份菜心種質(zhì)材料農(nóng)藝性狀的變異特征Table 3 Variation characteristics of agronomic traits in 156 flowering Chinese cabbage accessions

2.2 菜心群體中AUF2 基因的核苷酸多態(tài)性

通過PCR 擴(kuò)增和測(cè)序分析，顯示AUF2基因在菜心自然群體中存在豐富的自然變異，在2 996 bp 的擴(kuò)增區(qū)內(nèi)共鑒定出34 個(gè)變異位點(diǎn)，包含31個(gè)SNP和3個(gè)InDel，構(gòu)成36個(gè)單倍型（圖1、表4），其中31 個(gè)SNP 中堿基的轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)分別為23、8 個(gè)，核苷酸多樣性（π）為0.00503，單倍型多樣性（Hd）為0.780。由表4 可知，上游非編碼區(qū)1 498 bp內(nèi)檢測(cè)到26個(gè)SNP和2個(gè)InDel（均缺失11 bp），構(gòu)成23 個(gè)單倍型，核苷酸多樣性（π）為0.00866，單倍型多樣性（Hd）為0.765；編碼區(qū)960 bp 內(nèi)檢測(cè)到5 個(gè)SNP（2 個(gè)SNP 為同義突變，3 個(gè)SNP 為非同義突變）和1 個(gè)InDel（缺失23 bp），構(gòu)成17 個(gè)單倍型，核苷酸多樣性（π）為0.00195，單倍型多樣性（Hd）為0.582；下游非編碼538 bp 范圍沒有檢測(cè)出變異位點(diǎn)。

表4 菜心群體中AUF2 基因的序列變異參數(shù)Table 4 Parameters for the sequence variants of AUF2 gene in flowering Chinese cabbage population

選用Tajima’s D、Fu and Li’s D*和Fu and Li’s F*等中性檢驗(yàn)評(píng)價(jià)基因是否受到選擇作用。在中性進(jìn)化模型下，這些統(tǒng)計(jì)值為零，當(dāng)統(tǒng)計(jì)值為負(fù)值通常是由于定向選擇引起，而當(dāng)統(tǒng)計(jì)值為正值時(shí)則由平衡選擇引起［22］。由表4 可知，AUF2基因在菜心自然群體中Tajima’s D 值為4.27790，在P<0.001 水平上顯著偏離中性選擇，表明其存在大量中等頻率的等位位點(diǎn)，可能的原因是群體瓶頸效應(yīng)或平衡選擇；Fu and Li’s D*值和Fu and Li’s F*值分別為2.06339 和3.57745，在P<0.02水平上顯著偏離中性檢測(cè)。不同區(qū)段的中性檢驗(yàn)顯示，AUF2基因上游非編碼區(qū)顯著偏離中性選擇，但在編碼區(qū)偏離中性選擇不顯著。該結(jié)果說明，AUF2基因在菜心馴化過程中經(jīng)受了更大的選擇壓力，可能是選擇的靶標(biāo)候選基因。

2.3 AUF2 基因的多態(tài)位點(diǎn)與菜心農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

采用Tassel 5.0軟件中的混合線性模型（MLM）對(duì)AUF2基因的多態(tài)位點(diǎn)與菜心的株高、單株質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬、最大葉柄長和葉綠素含量（SPAD 值）等6 個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示有4 個(gè)SNP 分別與單株質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬和最大葉柄長等4 個(gè)農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)（P<0.01），其對(duì)表型變異的解釋率在5.04%～6.52%之間，平均值為5.69%（表5）。其中SNP_1267 與單株質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬和最大葉柄長等4 個(gè)農(nóng)藝性狀都顯著相關(guān)，對(duì)表型變異的解釋率分別為5.43%、6.42%、5.04%和6.52%，優(yōu)異等位變異為A 堿基，占檢測(cè)樣本的頻率為25.00%；SNP_1346、SNP_1461和SNP_1504 等3 個(gè)位點(diǎn)都與最大葉柄長顯著相關(guān)，對(duì)表型變異的解釋率分別為5.30%、5.47%和5.66%，其優(yōu)異等位變異分別是C、C 和T 等堿基，占檢測(cè)樣本的頻率分別為26.28%、28.85%和25.64%。SNP_1267、SNP_1346 和SNP_1461 3 個(gè)變異位點(diǎn)位于5'端的非編碼區(qū)，SNP_1504 為編碼區(qū)的非同義突變，導(dǎo)致其氨基酸由天冬氨酸突變?yōu)槔i氨酸。

表5 與菜心農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP 位點(diǎn)Table 5 SNPs loci significantly associated with agronomic traits in flowering Chinese cabbage

在156個(gè)菜心種質(zhì)中，SNP_1267、SNP_1346、SNP_1461 和SNP_1504 等4 個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SNP 位點(diǎn)構(gòu)成了7 個(gè)單倍型（表6），其中單倍型Hap1 由4 個(gè)最通常的堿基構(gòu)成，含110 個(gè)種質(zhì)材料，占總數(shù)的70.51%；單倍型Hap2 由4 個(gè)優(yōu)異等位變異構(gòu)成，含35 個(gè)種質(zhì)材料，占總數(shù)的22.44%；其余5 個(gè)單倍型為稀有單倍型，其占比均小于5%。與單倍型Hap1 相比，單倍型Hap2的單株質(zhì)量在P<0.05 水平上顯著增加，最大葉柄長在P<0.01 水平上極顯著提高，而株高、最大葉長、最大葉寬和葉綠素含量（SPAD 值）等4個(gè)農(nóng)藝性狀無顯著差異（表7）。

表6 4 個(gè)顯著關(guān)聯(lián)SNP 位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型Table 6 Haplotypes formed by 4 significantly associated SNPs

表7 2 個(gè)主要單倍型對(duì)菜心農(nóng)藝性狀的影響Table 7 Effects of two haplotypes on agronomic traits of flowering Chinese cabbage

3 討論

檢測(cè)候選基因內(nèi)的等位變異，有助于鑒定和分離遺傳多樣性材料中有價(jià)值的等位變異。本研究發(fā)現(xiàn)AUF2基因在156 份菜心種質(zhì)群體中存在豐富的自然變異，在2 996 bp 的擴(kuò)增區(qū)內(nèi)共檢測(cè)到34 個(gè)變異位點(diǎn)，其中26 個(gè)SNP 和2 個(gè)InDel分布在上游非編碼區(qū)，5 個(gè)SNP 和1 個(gè)InDel 分布在編碼區(qū)。前人研究證實(shí)，基因內(nèi)的不同區(qū)域SNP 頻率不同，如編碼區(qū)比非編碼區(qū)存在更少的SNP 和InDel［23-24］。AUF2基因在菜心群體在中的核苷酸多樣性為0.00503，這一結(jié)果略高于甲基化相關(guān)基因在白菜和芥藍(lán)群體中核苷酸多樣性（0.004558 和0.004352）［25］，顯著高于β-CT亞基編碼基因accD在油菜群體中核苷酸多樣性（0.00009）［26］，這可能與試驗(yàn)材料的多樣性相關(guān)，也反映了基因變異的豐富程度。中性選擇性評(píng)價(jià)顯示AUF2基因的Tajima’s D 值、Fuand Li’s D*值和Fuand Li’s F*值均顯著偏離中性檢測(cè)，其可能是群體瓶頸效應(yīng)或平衡選擇的結(jié)果，前人通過分子標(biāo)記［27-29］對(duì)菜心的多樣性分析也表明菜心種質(zhì)材料間的遺傳背景較窄，這可能由于菜心僅是白菜的一個(gè)變種，起源于我國華南地區(qū)，栽培區(qū)域的局限及長期系統(tǒng)選育造成了種質(zhì)資源的親緣關(guān)系較近［29］。

對(duì)AUF2基因的多態(tài)位點(diǎn)與菜心6 個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 個(gè)SNP 同時(shí)與單株質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬和最大葉柄長等4 個(gè)農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)（P<0.01），還有3 個(gè)SNP與最大葉柄長顯著關(guān)聯(lián)（P<0.01），4 個(gè)SNP 對(duì)表型變異的解釋率在5.04%～6.52%之間，平均值為5.69%，優(yōu)異等位位點(diǎn)的頻率達(dá)到25%以上，其中3 個(gè)SNP 位于5’端的非編碼區(qū)，1 個(gè)SNP 為編碼區(qū)的非同義突變，導(dǎo)致酸性的天冬氨酸變?yōu)榉菢O性的纈氨酸，這種單一氨基酸的變化很容易破壞分子內(nèi)相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，影響蛋白質(zhì)的折疊方式、穩(wěn)定性、動(dòng)力學(xué)，并最終影響蛋白質(zhì)的功能［30］。由4 個(gè)優(yōu)異等位變異構(gòu)成的單倍型Hap2 在P <0.01 水平上顯著提高最大葉柄長的長度，這可能是AUF2基因促進(jìn)了細(xì)胞分裂素介導(dǎo)的細(xì)胞在伸長和分化區(qū)擴(kuò)張的結(jié)果［2］。葉柄長是白菜類蔬菜的重要農(nóng)藝性狀，影響作物的種植密度和外觀品質(zhì)。繆體云等［31］研究顯示，結(jié)球甘藍(lán)的葉柄長由2 對(duì)主基因控制，其遺傳率高達(dá)90.44%。李威等［32］和章云［33］利用大白菜DH 群體均鑒定到2 個(gè)與葉柄長相關(guān)的QTL 位點(diǎn)，解釋的遺傳貢獻(xiàn)率在6.29%～ 12.9%之間，劉洋［34］在構(gòu)建大白菜-菜心染色體片段替換系的基礎(chǔ)上，共檢測(cè)到8 個(gè)與葉柄長相關(guān)的QTL 位點(diǎn)，加性效應(yīng)在37.32%～ 62.61%之間，他們都在連鎖群A08 上檢測(cè)到1 個(gè)QTL 位點(diǎn)，這個(gè)QTL 位點(diǎn)可能與位于A08 染色體上的AUF2基因存在相互作用來調(diào)節(jié)白菜類蔬菜葉柄的長度，而關(guān)于AUF2基因調(diào)控葉柄長的分子機(jī)理還需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

AUF2基因在菜心群體中存在豐富的自然變異。在2 996 bp 的擴(kuò)增區(qū)內(nèi)共鑒定出34 個(gè)變異位點(diǎn)，其中上游非編碼區(qū)1 498 bp 內(nèi)含26 個(gè)SNP和2 個(gè)InDel，編碼區(qū)960 bp 內(nèi)含5 個(gè)SNP 和1 個(gè)InDel，而下游非編碼區(qū)538 bp 范圍沒有檢測(cè)出變異位點(diǎn)。中性檢測(cè)顯示，AUF2基因在菜心自然群體中Tajima’s D 值、Fuand Li’s D*值和Fuand Li’s F*值均顯著偏離中性選擇，其可能是群體瓶頸效應(yīng)或平衡選擇的結(jié)果。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，4 個(gè)SNP 位點(diǎn)與菜心的單株質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬和最大葉柄長等4 個(gè)農(nóng)藝性狀呈顯著相關(guān)性（P<0.01），其表型解釋率在5.04%～ 6.52%范圍，4 個(gè)優(yōu)異等位變異構(gòu)成的單倍型Hap2 能顯著提高菜心的單株質(zhì)量和最大葉柄長。這些優(yōu)異等位變異和單倍型可為菜心品種的遺傳改良提供參考。