賴幸菲，鄧 權，范神光，孫伶俐，陳若虹，黎秋華，張鎮(zhèn)標，孫世利

（1.廣東省農業(yè)科學院茶葉研究所/廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.北京快雪堂茶業(yè)有限公司，北京 100020）

【研究意義】普洱茶是以云南大葉種曬青綠茶為原料加工而成的一種后發(fā)酵茶類，按照加工工藝及品質特征分為普洱茶生茶和普洱茶熟茶兩種類型［1］。普洱茶生茶是云南生產的傳統(tǒng)歷史名茶，具有適宜長期存放的特點。傳統(tǒng)普洱茶（生茶）的存放屬于后發(fā)酵，后發(fā)酵是云南大葉種曬青毛茶或普洱茶生茶在特定的環(huán)境條件下，經微生物、酶、濕熱、氧化等綜合作用，其內含物質發(fā)生一系列轉化，形成普洱茶獨有品質特征的過程［1］。研究證明，普洱茶及其有效成分具有抗氧化、抗腫瘤、減肥、降血脂、降血糖、抗疲勞、抗病毒、殺菌消炎、保護神經等多種功效［2-3］。目前，有關不同儲存年份的普洱茶生茶抗氧化活性主要通過體外酶方法進行研究，而對其體內抗氧化的研究則鮮有報道。

【前人研究進展】 馬冰凇等［4-5］對普洱茶（生茶）倉儲陳化過程中的化學成分變化規(guī)律和體外抗氧化能力進行了研究，結果表明普洱茶（生茶）倉儲陳化過程中茶多酚、游離氨基酸、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子酸兒茶素沒食子酸酯（GCG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）等酯型兒茶素極顯著降低，楊梅素和沒食子酸含量極顯著增加，沒食子兒茶素（GC）、表兒茶素（EC）和表沒食子兒茶素（EGC）等非酯型兒茶素呈先增加后降低的變化趨勢，咖啡堿、可可堿和槲皮素含量無顯著變化；體外抗氧化能力試驗結果表明普洱茶（生茶）新茶的鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH 自由基清除能力和ABTS 自由基清除能力較陳茶高，而超氧陰離子自由基清除能力則比陳茶低。戚康標等［6］對不同儲存時間普洱茶生茶和熟茶的生化成分和抗氧化活性進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)隨著存放時間的增加，普洱茶生茶和熟茶的茶多酚、氨基酸和可溶性糖含量均顯著下降，其體外抗氧化活性也明顯減弱。孫世利等［7］研究了不同年份普洱茶生茶物質基礎和體外總抗氧化活性的變化，結果表明隨著貯存時間的增加，普洱茶生茶的茶多酚、兒茶素、氨基酸、咖啡堿含量顯著下降，沒食子酸、可溶性糖、茶紅素和茶褐素含量顯著增加，茶黃素含量則變化不大，體外總抗氧化活性差別較小。

【本研究切入點】本研究以不同儲存時間普洱茶生茶為試材，測定分析其生化成分的變化規(guī)律及其在自然衰老小鼠體內抗氧化能力的差異?！緮M解決的關鍵問題】通過測定比較不同儲存時間普洱茶生茶生化成分的含量，探討不同儲存時間對普洱茶生茶抗氧化能力的影響，以期為普洱茶生茶資源的開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021 年12 月至2022 年5 月在廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點實驗室進行。供試云南普洱茶生茶分別產于2014、2020 年，由北京快雪堂茶業(yè)有限公司提供。

小鼠規(guī)格：SPF級 C57BL/6雄性小鼠，10月齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)條件：小鼠飼養(yǎng)于25（±2）℃恒溫環(huán)境中，相對濕度為50%～60%，光照12 h/d，自由攝食飲水，在SPF級動物房適應性飼養(yǎng)1 周后進行試驗。

試劑：谷丙轉氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase，ALT/GPT）測試盒、谷草轉氨酶（Glutamic oxalacetic transaminase，AST/GOT）測試盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）測試盒、微量還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）測試盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測試盒，均購自南京建成生物工程有限公司。BCA 蛋白定量測試盒，Thermo Fisher Scientific；8 種兒茶素單體兒茶素（Catechin，C）、沒食子兒茶素（Gllocatechin，GC）、兒茶素沒食子酸酯（Catechin gallate，CG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin-3-gallate，GCG）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin-3-gallate，ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate，EGCG），購自Sigma 公司；咖啡堿、沒食子酸，購自上海源葉生物技術有限公司；甲醇、乙腈，色譜純；其他試劑均為分析純。

試驗儀器和設備：TriStar LB941 多功能酶標儀（德國Berthold Technologies 公司）；高速冷凍離心機 Eppendorf、1200 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；JH-12-06 型紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；OHAUS 準微量電子天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）；ZMQS5001 型Millipore 純水儀（密理博公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 普洱茶生茶水提物的制備 按茶水比（W/V）1:30 在95 ℃水浴中用沸蒸餾水浸提20 min，重復浸提2 次，浸提結束后過濾得到茶湯濾液，合并兩次茶湯濾液，進行旋轉蒸餾濃縮，冷凍干燥成凍干粉后，置于干燥器內密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 普洱茶生茶生化成分測定 按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》測定茶葉水分含量，按照國家標準“GB/T 8305-2013 茶水浸出物測定”測定茶水浸出物含量，按照國家標準“GB/T 8313—2018 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法”測定茶多酚含量，按照國家標準“GB/T 8314—2013 茶游離氨基酸總量的測定”測定茶葉中的游離氨基酸總量，采用蒽酮-硫酸比色法測定可溶性總糖含量，采用三氯化鋁比色法測定黃酮類含量。兒茶素單體、沒食子酸、咖啡堿含量參照國家標準“GB/T 8313—2018 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法”進行測定，并進行了改進，具體色譜條件如下：

色譜柱：phenomenex C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長280 nm；檢測溫度28 ℃；流動相A：含0.5%乙酸、1%乙腈和2%甲醇的水溶液，流動相B：含0.5%乙酸、10%乙腈和20%甲醇的水溶液；洗脫步驟：在30 min 內，A 相由72.5%到20%，B 相由27.5%到80%，30 min 后在5 min 內，A 相由20%恢復到72.5%，B相由80%恢復到27.5%，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。以外標法按峰面積進行定量。

1.2.3 普洱茶生茶體內抗氧化活性測定（1）小鼠分組與給藥。取供試小鼠30 只，隨機分成3組，每組10 只，分別設為正常對照組、2014 年普洱茶生茶組（2014 年產的普洱茶生茶水提物，1 000 mg/kg·BW）、2020 年普洱茶生茶組（2020年產的普洱茶生茶水提物，1 000 mg/kg·BW）。適應性飼養(yǎng)1 周后，第2 周開始每天對小鼠進行普洱茶生茶水提物灌胃，正常對照組用蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃21 d，每天灌胃1 次，自由攝食、飲水，每隔3 d 測量記錄小鼠體重、進食量和飲水量；第21 d 灌胃前禁食12 h，自由飲水，對各組小鼠進行給藥處理，末次灌胃結束1 h 后麻醉小鼠，進行心臟取血，解剖取肝臟、腎臟和脾臟組織稱重。

（2）小鼠肝臟ALT、AST、SOD活性和GSH、MDA 含量的測定。采血完成后處死小鼠，迅速解剖取出肝臟，用預冷生理鹽水漂洗并用濾紙吸干。剪取少量肝組織加入9 倍體積預冷的生理鹽水進行勻漿，于4 ℃、2 500 r/min 離心15 min，得到上清液。按照試劑盒說明書的方法測定肝臟組織中ALT、AST、SOD 活性和GSH、MDA含量。肝組織定量蛋白按照BCA 蛋白定量測試盒說明書的方法對肝組織上清液進行蛋白定量。

（3）小鼠血清中AST、SOD 活性和MDA 含量的測定。收集小鼠血液靜置30 min 后，于4 ℃、3 000 r/min 離心20 min，分離得到血清，按照試劑盒說明書的方法檢測血清中AST、SOD 活性和MDA 含量。

試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行繪圖和統(tǒng)計分析，結果以±s 表示，采用t檢驗（Student’s t test）或單因素方差（one-way ANOVA）分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同年份普洱茶生茶生化成分分析比較

由表1 可知，2014 年的普洱茶生茶水浸出物、氨基酸、咖啡堿含量分別為40.11%、3.15%、4.18%，2020 年的普洱茶生茶水浸出物、氨基酸、咖啡堿含量分別為40.78 %、3.32%、5.83%，前者這3 個成分含量均極顯著低于后者；前者的沒食子酸含量（0.38%）極顯著高于后者（0.20%）。由表2 可知，2014 年普洱茶生茶的GC、EGC、C、EC、EGCG、CG 含量分別為0.21%、0.84%、0.61%、2.46%、6.90%、0.10%，非酯型兒茶素含量（4.11%）、酯型兒茶素含量（13.44%）和兒茶素總量（17.55%）均極顯著低于2020 年的普洱茶生茶。綜上，隨著儲存時間的增加，普洱茶生茶的水浸出物、氨基酸、咖啡堿及兒茶素含量均有所下降，沒食子酸則有所增加。

表1 不同年份普洱茶生茶生化成分質量分數(shù)（%）Table 1 Contents of the biochemical components in Pu-erh raw tea in different years(%)

表2 不同年份普洱茶生茶兒茶素質量分數(shù)（%）Table 2 Contents of catechins in Pu-erh raw tea in different years (%)

2.2 不同年份普洱茶生茶對老齡小鼠體重、飲水量和進食量的影響

由圖1A 可知，灌胃21 d 后，正常對照組小鼠體重與初始體重相比沒有顯著增加，各給茶組小鼠體重與初始體重相比有所下降，但差異不顯著，與正常組相比差異也不顯著。圖1B、C 結果表明，在試驗期間，正常組小鼠飲水量和進食量呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，各給茶組小鼠的飲水量和進食量也呈現(xiàn)出相同的趨勢，與正常組相比，給茶組小鼠的飲水量和進食量有所下降，但差異均不顯著。

圖1 不同年份普洱茶生茶對老齡小鼠體重（A）、飲水量（B）和進食量（C）的影響Fig.1 Effects of Pu-erh raw tea in different years on weight (A),water consumption (B) and food intake (C) of aged mice

2.3 不同年份普洱茶生茶對老齡小鼠臟器指數(shù)的影響

小鼠臟器指數(shù)的變化可以間接反映動物體衰老的程度。肝臟、腎臟是動物機體重要的代謝器官，若肝腎指數(shù)降低，會影響動物代謝能力；脾臟是動物體內的免疫器官，脾臟重量若降低、萎縮可使動物免疫功能下降。由圖2 可知，試驗結束時，與正常對照組的老齡小鼠相比，各給茶組小鼠的肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)稍有下降，但差異均不顯著。

圖2 不同年份普洱茶生茶對老齡小鼠肝臟指數(shù)（A）、腎臟指數(shù)（B）和脾臟指數(shù)（C）的影響Fig.2 Effects of Pu-erh raw tea in different years on liver index (A),kidney index (B) and spleen index (C) of aged mice

2.4 不同年份普洱茶生茶對老齡小鼠肝臟和血清中ALT 和AST 活性的影響

ALT 和AST 活性偏高是反映肝臟功能不正常的一個重要指標，體內炎癥和氧化應激均可引起ALT 和AST 活性偏高。由圖3A、B 可知，與正常對照組小鼠相比，給茶組小鼠肝臟的ALT 和AST活性有所下降，但未達到顯著差異。圖3C 結果表明，正常對照組小鼠血清AST 的活性為59.60 U/L，2014 年普洱茶生茶組小鼠血清AST 活性為21.49 U/L，2020 年普洱茶生茶組小鼠血清AST 活性為29.50 U/L，給茶組小鼠血清的AST 活性均極顯著下降（P＜0.01）。

圖3 不同年份普洱茶生茶對老齡小鼠肝臟和血清中ALT 和AST 活性的影響Fig.3 Effects of Pu-erh raw tea in different years on ALT and AST activity in the liver and the serum of aged mice

2.5 不同年份普洱茶生茶對老齡小鼠肝臟和血清SOD 活性、GSH 和MDA 含量的影響

SOD 是機體主要抗氧化酶，保護細胞免受氧化應激損傷。由圖4A 可知，與正常對照組小鼠肝臟SOD 活性（288.53 U/mgprot）相比，給茶組小鼠肝臟SOD 的活性（363.41、343.53 U/mgprot）均有所增加，但均未達到顯著差異；圖4B 的結果也顯示，與正常組對照組小鼠血清SOD 活性（38.59 U/mL）相比，給茶組小鼠血清SOD 活性（38.52、34.79 U/mL）均未有增加。

圖4 不同年份普洱茶生茶對老齡小鼠肝臟和血清中SOD 活性、GSH 和MDA 含量的影響Fig.4 Effects of Pu-erh raw tea in different years on SOD activity,GSH and MDA content in the liver and the serum of aged mice

GSH 是機體內最重要的非酶性抗氧化物，其含量越高，機體抗氧化能力越強。由圖4C 可知，正常對照組小鼠肝臟GSH 含量為19.17 μmol/gprot，2014 年普洱茶生茶組小鼠肝臟GSH 含量為77.28 μmol/gprot，2020 年普洱茶生茶組小鼠肝臟GSH 含量為41.54 μmol/gprot?？梢姡c正常對照組相比，給茶組小鼠肝臟GSH 含量均明顯增加，差異極顯著（P＜0.01）。

MDA 含量可間接反映機體細胞損傷程度，其含量越高，機體脂質過氧化程度越高，細胞損傷程度也越高。由圖4D 可知，正常對照組小鼠肝臟MDA含量為1.78 nmol/mgprot，2014 年普洱茶生茶組小鼠肝臟MDA 含量為1.16 nmol/mg prot，2020 年普洱茶生茶組小鼠肝臟MDA 含量為1.32 nmol/mgprot，與正常組對照組相比，給茶組小鼠肝臟MDA 含量均有所下降，但未達到顯著差異。圖E 的結果表明，與正常對照組小鼠血清MDA 含量（18.53 nmol/mL）相比，2014 年普洱茶生茶組小鼠血清MDA 含量（17.78 nmol/mL）略有下降，2020 年普洱茶生茶組小鼠血清MDA 含量（11.67 nmol/mL）下降較多，但均未達到顯著差異。

3 討論

傳統(tǒng)的普洱茶生茶是以符合普洱茶產地環(huán)境條件下生產的云南大葉種茶樹鮮葉為原料，經殺青、揉捻、日光干燥、蒸壓成型等工藝制成的緊壓茶，而后存放中經微生物、酶、濕熱、氧化等綜合作用，其內含物質發(fā)生一系列轉化，形成普洱茶獨有品質［1,8-9］。有研究者采用代謝組學方法研究普洱生茶貯存過程中內含物質的變化，結果顯示普洱生茶在貯存前期內含物質變化不大，貯存5 年后其內含物質才有明顯變化［10］。眾多研究結果表明，隨著貯存時間增加，普洱茶生茶的茶多酚和氨基酸的含量明顯減少，沒食子酸含量明顯增加［4-7,11］，本研究結果與前人的研究結果相符。馬冰凇等［4］研究發(fā)現(xiàn)，隨著貯存時間增加，普洱茶生茶的兒茶素總量及兒茶素單體中酯型兒茶素EGCG、GCG、ECG 的含量明顯下降，非酯型兒茶素GC、EC、EGC 的含量呈先上升再下降的趨勢，咖啡堿的含量則變化不大；孫世利等［7］研究結果表明，兒茶素總量、8 種兒茶素單體以及咖啡堿的含量均隨著貯存時間增加而減少；宋瑩等［11］的研究顯示，兒茶素總量和咖啡堿的含量變化不明顯。本研究中，2020 年產的普洱茶生茶的兒茶素總量、各兒茶素單體和咖啡堿的含量均比2014 年產普洱茶生茶高，這與孫世利等［7］的研究結果相符。馬冰凇等［4］、戚康標等［6］研究表明，普洱茶生茶的可溶性糖含量隨著貯存時間增加呈下降趨勢，孫世利等［7］的研究結果則相反，而宋瑩等［11］研究表明可溶性糖含量變化不明顯。本研究結果顯示，2014 年產普洱生茶的可溶性糖含量比2020 年的高。綜上，隨著儲存時間的增加，普洱茶生茶中茶多酚、兒茶素、氨基酸含量呈減少趨勢，沒食子酸含量呈增加趨勢，咖啡堿、可溶性糖等的含量可能受茶葉原料、貯存條件和時間等影響而表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，這有待進一步研究。

根據(jù)Denh am Harman 衰老的自由基學說，其認為衰老過程中的退行性變化是由于細胞正常代謝過程中產生的自由基的有害作用造成的［12］。天然抗氧化活性物質被人體吸收后，能提高體內相關抗氧化酶類活性，可直接清除自由基［13］。國內外大量研究結果表明，茶葉及其有效成分在體內和體外均具有良好的抗氧化活性［14-19］。本研究以自然衰老小鼠為研究對象，探討不同儲存時間普洱茶生茶的體內抗氧化能力。隨著年齡增長，機體內的器官逐漸衰竭，功能活性呈下降趨勢。ALT 和AST 分布于人體多個器官組織中，其中肝臟內含量最多，當肝組織細胞受到損傷時，肝臟細胞和血清中的ALT 和AST 活性會提高［19］。本研究結果顯示，儲存時間較長的普洱茶生茶（2014 年）能極顯著降低老齡小鼠血清和肝臟的AST 活性，儲存時間較短的普洱茶生茶（2020 年）除了能極顯著降低老齡小鼠血清和肝臟的AST 活性外，還能極顯著降低肝臟的ALT 活性。衰老的自由基理論認為，隨著年齡的增加，體內抗氧化酶活性及非酶性抗氧化物含量下降，過氧化產物增多，自由基生成和消除失衡，氧自由基大量積聚，造成組織細胞的過氧化損傷［20］。SOD 是機體的主要抗氧化酶，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，SOD 能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷［21］。本研究結果表明，灌胃普洱茶生茶后老齡小鼠肝臟的SOD 活性有所增加，但與正常對照組相比沒有達到顯著差異，且對老齡小鼠血清中的SOD 活性沒有影響。GSH是機體內最重要的非酶性抗氧化物，具有清除自由基、解毒、促進鐵質吸收，維持紅細胞膜的完整性、脫氧核糖核酸的生物合成、細胞的正常生長發(fā)育及細胞免疫等多種重要生理功能。GSH 是一種低分子清除劑，可清除O2-、H2O2、LOOH，因而GSH 含量是衡量機體抗氧化能力的重要因素［22］。本研究結果表明，通過灌胃普洱茶生茶后，老齡小鼠肝臟的GSH 含量與正常對照組相比均有所增加，其中2014 年產普洱茶生茶的GSH 含量極顯著增加。MDA 含量常常可反映機體內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同云南古茶樹茶水浸提液后，給茶組小鼠肝臟的MDA 含量與正常對照組相比均有所下降，但未達到顯著差異?？梢?，不同儲存時間普洱茶生茶均具有體內抗氧化作用并有所差異，這可能與其存放過程中兒茶素生化成分變化有關，不同儲存時間普洱茶生茶的體內抗氧化作用分子機制有待進一步研究。

4 結論

與2020 年普洱茶生茶相比，2014 年普洱茶生茶的水浸出物（40.11%）、氨基酸（3.15%）、咖啡堿（4.18%）、GC（0.21%）、EGC（0.84%）、C（0.61%）、EC（2.46%）、EGCG（6.90%）、CG（0.10%）、非酯型兒茶素（4.11%）、酯型兒茶素（13.44%）和兒茶素總量（17.55%）均極顯著下降，而沒食子酸含量（0.38%）極顯著增加，且隨著存放時間的增加普洱茶生茶的生化成分差異較大。2014 年普洱茶生茶可極顯著地降低老齡小鼠血清的AST 活性（21.49 U/L），提高肝臟GSH 的含量（77.28 μmol/gprot）、SOD 活性，降低肝臟的AST 活性和MDA 含量；2020 年普洱茶生茶可極顯著地降低老齡小鼠血清的AST 活性（29.50 U/L），提高肝臟的SOD 活性和GSH 含量，降低肝臟的ALT 和AST 活性以及肝臟和血清中的MDA 含量。不同儲存時間普洱茶生茶均具有體內抗氧化作用并表現(xiàn)出差異，儲存時間較長的普洱茶生茶提高體內抗氧化酶類SOD 活性和提高GSH含量的能力較強。