費(fèi)松 吳偉東 王瑛 古佳升 桃卓嫣 方明星 李丹
【摘 要】目的 評估小分子透明質(zhì)酸與β-葡聚糖、聚乳酸、羥基磷灰石聯(lián)合應(yīng)用的組織相容性。方法Wistar大鼠18只隨機(jī)分為3期實(shí)驗(yàn)各6只,于背部劃分4個(gè)部位,根據(jù)注射不同配方的試劑分為4組。對照組注射小分子透明質(zhì)酸1.00 ml,葡聚糖組注射0.25 ml小分子透明質(zhì)酸+0.75 mlβ-葡聚糖,聚乳酸組注射0.25 ml小分子透明質(zhì)酸+0.75 ml聚乳酸,羥基磷灰石組注射0.25 ml小分子透明質(zhì)酸+0.75 ml羥基磷灰石,分別于注射7、14、28 d后處死大鼠,取其注射部位組織制成切片,經(jīng)HE染色后觀察免疫反應(yīng),免疫印跡法檢測第三期實(shí)驗(yàn)大鼠皮膚組織中白介素1的表達(dá)水平。結(jié)果 7 d實(shí)驗(yàn)中聚乳酸及羥基磷灰石組表現(xiàn)出輕微的免疫反應(yīng),14 d實(shí)驗(yàn)中各組的免疫反應(yīng)均呈上升趨勢,28 d實(shí)驗(yàn)中各組的免疫反應(yīng)均消退;免疫印跡法結(jié)果顯示,28 d實(shí)驗(yàn)中三組注射部位的IL-1均低表達(dá),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 小分子透明質(zhì)酸與β-葡聚糖、聚乳酸、羥基磷灰石的聯(lián)合應(yīng)用具有較好的組織相容性。
【關(guān)鍵詞】透明質(zhì)酸;β-葡聚糖;聚乳酸;羥基磷灰石
中圖分類號:R318.08 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1004-4949(2023)08-0095-04
Compatibility Evaluation of Low Cross-linked Hyaluronic Acid Combined with Recycled Materials
FEI Song1, WU Wei-dong 1, WANG Ying2, GU Jia-sheng1, TAO Zhuo-yan1, FANG Ming-xing1, LI Dan1
(1.Department of Cardiothoracic Surgery, Guangzhou Red Cross Hospital of Jinan University, Guangzhou 510000, Guangdong, China; 2.Guangzhou Xiao Man Yao Medical Equipment Co., Ltd., Guangzhou 510000, Guangdong, China)
【Abstract】Objective To evaluate the histocompatibility of small molecular hyaluronic acid combined with β-glucan, polylactic acid and hydroxyapatite. Methods Eighteen Wistar rats were randomly divided into three phases of experiments, with 6 rats in each phase. Four parts were divided on the back and divided into 4 groups according to different formulations of reagents. The control group was injected with 1.00 ml of small molecular hyaluronic acid, the dextran group was injected with 0.25 ml of small molecular hyaluronic acid+0.75 ml of β-glucan, the polylactic acid group was injected with 0.25 ml of small molecular hyaluronic acid+0.75 ml of polylactic acid, and the hydroxyapatite group was injected with 0.25 ml of small molecular hyaluronic acid+0.75 ml of hydroxyapatite. The rats were sacrificed after 7, 14 and 28 days of injection, and the tissues at the injection site were taken and made into sections. The immune response was observed after HE staining, and the expression level of interleukin 1 in the skin tissue of the third phase of the experimental rats was detected by Western blotting. Results In the 7 d experiment, the polylactic acid and hydroxyapatite groups showed a slight immune response. In the 14 d experiment, the immune response of each group showed an upward trend, and the immune response of each group subsided in the 28 d experiment. The results of immunoblotting showed that the expression of IL-1 in the injection site of the three groups was low in the 28 d experiment, and the difference was not statistically significant (P>0.05). Conclusion The combination of small-molecule hyaluronic acid with β-glucan, polylactic acid and hydroxyapatite has good histocompatibility.
【Key words】Hyaluronic acid; β-glucan; Polylactic acid; Hydroxyapatite
皮膚的彈性和水分會隨著年齡的增長或受周圍環(huán)境的影響引起水分和膠原的流失[1],為解決這一問題,醫(yī)學(xué)上多采用皮下注射填充物來保障水分的保持或促進(jìn)組織膠原的生成。目前醫(yī)學(xué)上使用較多的皮下填充產(chǎn)品有透明質(zhì)酸、β-葡聚糖、聚乳酸、羥基磷灰石鈣等。各種材料都有其特點(diǎn),也有不足之處,材料與材料間的聯(lián)合應(yīng)用或聯(lián)合微針等方式可獲得更好的治療效果。透明質(zhì)酸已經(jīng)廣泛用于皮膚美容[2],通過與其他材料聯(lián)合應(yīng)用或聯(lián)合其他療法,可提高療效[3],同時(shí)也可能引起一系列的不良反應(yīng),如血管栓塞、感染、組織壞死等。因此,為評價(jià)不同皮下填充材料的生物安全性,本實(shí)驗(yàn)將以小分子透明質(zhì)酸為對照組,小分子透明質(zhì)酸聯(lián)合β-葡聚糖、聚乳酸、羥基磷灰石等已經(jīng)在市面上廣泛使用的填充材料為實(shí)驗(yàn)組,于大鼠皮下注射,觀察不良反應(yīng)和微觀下免疫反應(yīng),通過各組注射材料的結(jié)果互相比較,以評估聯(lián)合應(yīng)用材料的安全性。
1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級 Wistar 大鼠18只(購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理中心),周齡6周,體重(200±20)g,動物實(shí)驗(yàn)按照《國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理與使用指南》進(jìn)行,倫理號HTSW211103。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境:室溫(25±2)℃,相對濕度(50±5)%,12 h明暗交替,分籠飼養(yǎng),自由攝食飲水,飼養(yǎng)7 d。
1.2 試劑與儀器 小分子透明質(zhì)酸(廣州小蠻腰醫(yī)療器械有限公司);β-葡聚糖(廣州小蠻腰醫(yī)療器械有限公司);聚乳酸;羥基磷灰石;白介素1(IL-1)和GADPH兔一抗抗體(博奧森),IL-1和GADPH羊抗兔二抗抗體(博奧森);無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);二甲苯(天津市富宇精細(xì)化工有限公司);伊紅染液、蘇木素染液、中性樹膠(谷歌生物科技有限公司);顯微鏡(上海通灝光電科技有限公司);攤烤片機(jī)(湖北安立信醫(yī)療實(shí)業(yè)有限公司);脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司);包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)。
1.3 實(shí)驗(yàn)分組 18只大鼠編號后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3期實(shí)驗(yàn),每期各6只,分別為7 d一期實(shí)驗(yàn)、 14 d二期實(shí)驗(yàn)和28 d三期實(shí)驗(yàn),大鼠背部各選取4個(gè)注射點(diǎn),注射間隔1 cm以上,注射劑量均為1 ml,根據(jù)注射材料不同分為4組。對照組注射小分子透明質(zhì)酸1 ml;葡聚糖組注射小分子透明質(zhì)酸0.25 ml+β-葡聚糖0.75 ml;聚乳酸組注射小分子透明質(zhì)酸0.25 ml+聚乳酸0.75 ml;羥基磷灰石組注射小分子透明質(zhì)酸0.25 ml+羥基磷灰石0.75 ml。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法 18只大鼠禁食12 h、禁水4 h后,稱重,采用7%水合氯醛(劑量:0.03 ml/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉。麻醉成功后對大鼠背部皮膚進(jìn)行備皮,選取脊柱旁兩側(cè)約2 cm 皮下組織為注射中心點(diǎn),以注射點(diǎn)中心劃分1.5 cm寬度的正方形區(qū)域使用記號筆標(biāo)注,一只大鼠背部脊柱兩側(cè)分別標(biāo)注4個(gè)區(qū)域。經(jīng)75%醫(yī)用酒精擦拭皮膚表面消毒;利用30 G注射針頭斜面向上刺入表皮至皮下組織層,回抽無回血后進(jìn)行注射,每個(gè)部位注射對應(yīng)的劑量為1 ml,射后予以輕度按摩使材料分布更均勻。注射完成后常規(guī)飼養(yǎng)規(guī)飼養(yǎng),于7、14、28 d后,分別采用脊髓脫臼法處死對應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的大鼠,去除大鼠背部毛發(fā),對標(biāo)記筆標(biāo)注的注射區(qū)域用手術(shù)刀切開皮膚全層,拍照記錄,使用蚊式鉗鈍性分離剩余的注射材料及周圍組織,保持包膜完整。
1.4.1蘇木精-伊紅染色法 用組織剪剪取殘余的皮下組織,于10%甲醛溶液中固定48 h。流水緩慢沖洗4~8 h以洗去甲醛;將包埋塊裝在一個(gè)網(wǎng)兜里,放入70%乙醇過夜。第2天,依次放入80%、90%、100% A、100% B乙醇浸泡各1 h,二甲苯A、二甲苯B各浸泡30 min,至組織塊呈現(xiàn)棕黃色或暗紅色透明狀,放入水浴機(jī)石蠟缸A、B、C各1.5 h(60 ℃),包埋塊和包埋模具放入包埋儀至少30 min,包埋后關(guān)閉水浴箱,使用萊卡切片機(jī)切片,厚度為4 μm,45 ℃攤片,烤片機(jī)75 ℃烤片60 min。將石蠟切片放入染色盒,用二甲苯A、B、C各脫蠟5 min。依次100%、95%、80%、70%的酒精,入蒸餾水2次,5 min/次。蘇木素染核1 min,流水沖洗干凈,0.1%鹽酸酒精分化10 s,入蒸餾水放置10 min。0.5%伊紅染色1 min,流水沖洗干凈,入蒸餾水3 min,取出玻片放在通風(fēng)櫥里晾干。用中性樹膠對晾干的組織切片進(jìn)行封片。在光學(xué)顯微鏡下找到目標(biāo)部位,拍照。
1.4.2免疫印跡法 將用組織剪剪取皮下組織后提取組織總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白定量后將蛋白樣品調(diào)至等濃度,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后,4 ℃冰箱孵育IL-1和GADPH-抗過夜,與相應(yīng)二抗室溫下孵育2 h,ECL顯影,拍照,進(jìn)行圖像分析。以Image J 軟件分析蛋白條帶得到的灰度值表示IL-1蛋白的相對表達(dá)水平,以GADPH為內(nèi)參,實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次以上,取平均值。
1.5 組織學(xué)評價(jià) 皮膚對材料的免疫反應(yīng)的程度按照2015國家食品藥品監(jiān)督管理局濟(jì)南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第6部分:植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)半定量評分系統(tǒng)中的生物學(xué)反應(yīng)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)細(xì)胞類型/反應(yīng)、新血管生成、纖維化、脂肪浸潤等情況進(jìn)行評價(jià),實(shí)驗(yàn)組評分減去對照組的評分,得到的差值作為判斷材料對組織的刺激等級,具體判定標(biāo)準(zhǔn)為:無刺激:0~2.9分;輕度刺激:3.0~8.9分;中度刺激:9.0~15.0分;重度刺激:>15.0分。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以(x-±s)表示,多組間比較行F檢驗(yàn);P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
術(shù)后大鼠進(jìn)食,活動均正常,術(shù)后背部局部無明顯腫脹,所有實(shí)驗(yàn)動物均存活。
2.1 皮膚組織大體觀 皮膚外可見注射材料所在部位有輕微凸起,無明顯紅腫、壞死、化膿。皮下解剖可見清晰的血管形狀,注射材料所在部位的周圍組織與其他部位組織無明顯改變,無血管栓塞、組織壞死等表現(xiàn),見圖1。
2.2 生物反應(yīng)評價(jià) 每期實(shí)驗(yàn)6只大鼠相同材料部位的評分取平均值,刺激平均評分=實(shí)驗(yàn)組平均評分-對照組平均評分,結(jié)果見表2。7 d實(shí)驗(yàn)中,各組刺激性分級情況均低;14 d實(shí)驗(yàn)中,與對照組相比,葡聚糖組、聚乳酸組及羥基磷灰石組刺激分級均表現(xiàn)出一定的刺激性;28 d實(shí)驗(yàn)中,各組的刺激性分級情況均偏低,且呈下降趨勢,見表1。
2.3 術(shù)后三期實(shí)驗(yàn)各組材料注射部位宿主反應(yīng) 7 d實(shí)驗(yàn)中,對照組僅有少量炎細(xì)胞浸潤;葡聚糖組除少量炎細(xì)胞外,還有一些纖維形成;聚乳酸組出現(xiàn)大量的炎細(xì)胞,纖維囊壁形成廣泛且排列紊亂,羥基磷灰石中的炎細(xì)胞程度輕微,可見少許血管。14 d實(shí)驗(yàn)中,對照組的炎細(xì)胞較前減輕,且開始出現(xiàn)纖維層;葡聚糖組的炎細(xì)胞繼續(xù)增加,且纖維層較前明顯增多增厚,排列整齊,出現(xiàn)少許新生血管;聚乳酸組的炎細(xì)胞更為明顯,且纖維層較前整齊,出現(xiàn)大量的新生血管;羥基磷灰石的炎細(xì)胞反應(yīng)較前減退,且纖維較前增厚,且紊亂。28 d實(shí)驗(yàn)中,對照組的纖維層繼續(xù)增厚增多,炎細(xì)胞沒有繼續(xù)上升的趨勢;葡聚糖組的炎性反應(yīng)明顯下降,且纖維層繼續(xù)增多增粗,排列整齊;此外,可見大量小血管生成;聚乳酸組炎細(xì)胞較前輕微,纖維層繼續(xù)增粗但排列紊亂,未見14 d時(shí)豐富的新生小血管;羥基磷灰石組幾乎不可見血管生成,炎細(xì)胞消退,纖維層較對照組明顯薄弱。HE染色實(shí)驗(yàn)切片見圖2。
2.4 IL-1的表達(dá)水平 免疫印跡法結(jié)果顯示,28 d實(shí)驗(yàn)中三組注射部位的IL-1均呈低表達(dá),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,F(xiàn)=2.101),見圖3。
透明質(zhì)酸是一種細(xì)胞外基質(zhì)的天然糖胺聚糖,具有良好的保濕功能,能夠改善皮膚干燥粗糙、毛孔粗大等問題[4]。β-葡聚糖是一種以糖苷鍵連接的同型多糖,不僅能作為血漿替代物,還能增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性,促進(jìn)傷口愈合,同時(shí)可延緩皮膚老化,是一種良好的皮膚填充材料。聚乳酸是從可再生植物中提取發(fā)酵而來的聚合物,對人體無毒無害,且生物相容性良好,可降解,作為一種醫(yī)學(xué)高分子材料,常用于組織修復(fù)。
本次三期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),所有實(shí)驗(yàn)組均表現(xiàn)出一定的炎細(xì)胞及組織反應(yīng),但在28 d時(shí)均逐漸消退,各組均未表現(xiàn)出明顯的纖維化、組織紊亂、壞死,注射材料引起的免疫反應(yīng)最后都基本消退,表現(xiàn)出良好的組織相容性。在生物反應(yīng)性評價(jià)平均評分上看,葡聚糖組及聚乳酸組的評分在后兩期實(shí)驗(yàn)中,特別是第二期的表現(xiàn)是要稍微高于其他兩組的,造成這種現(xiàn)象的原因主要是β-葡聚糖由于被免疫活性細(xì)胞膜上的受體識別,激活了包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞等,促進(jìn)細(xì)胞釋放白介素,因此白介素的表達(dá)水平較高。而聚乳酸在代謝過程中產(chǎn)生乳酸,刺激成纖維母細(xì)胞的增殖和膠原蛋白再生,在這個(gè)過程中產(chǎn)生了一定的免疫反應(yīng)。透明質(zhì)酸會在透明質(zhì)酸酶及透明質(zhì)酸降解蛋白(HYAL1和HYAL2)的參與下被降解,但這個(gè)過程并不會引起明顯的組織反應(yīng)。透明質(zhì)酸注射后能刺激轉(zhuǎn)化生長因子,結(jié)締組織生長因子等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,促進(jìn)膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的合成,表現(xiàn)出一定的纖維增生。β-葡聚糖在7、14 d實(shí)驗(yàn)中引起免疫反應(yīng),一方面激活成纖維細(xì)胞,不斷分泌前膠原蛋白,并形成膠原纖維,另一方面使組織中的巨噬細(xì)胞數(shù)量增加,巨噬細(xì)胞促進(jìn)組織成EGFR表皮生長因子和VEGF血管生成因子的分泌,兩者共同作用于內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)新生血管的形成。同時(shí),28 d實(shí)驗(yàn)中三組注射部位的IL-1均呈低表達(dá),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),證實(shí)了透明質(zhì)酸聯(lián)合其他材料注射的安全性良好。
綜上所述,小分子透明質(zhì)酸與β-葡聚糖、聚乳酸、羥基磷灰石的聯(lián)合應(yīng)用具有較好的組織相容性。
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編輯 扶田