李賽,龔詠晴,向花花,董巍檑,馬艷,郭紫芬(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院 .附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,.藥學(xué)院藥物藥理研究所,湖南衡陽 421001)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma,EC)是女性生殖道常見的婦科惡性腫瘤之一,近年來其發(fā)生率呈上升趨勢。第10號染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白(The phosphate and tension homolog,PTEN)基因是繼p53基因后新發(fā)現(xiàn)的又1個抑癌基因。研究表明,在子宮內(nèi)膜癌中PTEN基因突變比包括kras和p53在內(nèi)的其他任何基因都更為普遍[1]。一項(xiàng)對國外子宮內(nèi)膜癌患者進(jìn)行PTEN基因缺失情況的研究顯示,PTEN基因突變率達(dá)50%,是子宮內(nèi)膜癌相關(guān)基因中突變率最高的基因,又被稱為子宮內(nèi)膜癌的管家基因[2]。通過在線查詢COSMIC-CGC數(shù)據(jù)庫及國外研究PTEN基因突變譜分析,證實(shí)第5外顯子與第8外顯子突變是其熱點(diǎn)突變區(qū)域[3-4],但國內(nèi)目前尚未見針對第8外顯子968delA突變情況的報道。由于遺傳背景、種族差異、地域等的差異性很大程度影響到了多態(tài)性位點(diǎn)基因頻率的分布,因此,筆者擬運(yùn)用本研究所前期研究中成功建立的分子開關(guān)技術(shù)[5],構(gòu)建對PTEN基因968delA位點(diǎn)突變進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測的技術(shù)平臺,并初步探討中國人群子宮內(nèi)膜癌患者PTEN基因968delA位點(diǎn)突變情況,以期為國內(nèi)子宮內(nèi)膜癌的診治和早期篩查提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 MD2000D微量紫外分光光度計(jì)(英國Biofuture公司),MyCycler普通PCR儀(美國Bio-Rad 公司) 。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209-02)、離心柱形質(zhì)粒小提試劑盒(D6943-01)購自美國Omega公司,血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)、2×Pfu PCR Master Mix(KP201)、100 bp DNA Ladder(MD101-01)、溴化乙錠購自北京天根公司,瓊脂糖、EDTA、Tris(河北宏進(jìn)化工公司)。大腸埃希菌EColi.DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存;突變型質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒模板由本研究所前期試驗(yàn)中構(gòu)建。

1.2臨床樣本 收集2015年5月至2017年1月于南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科經(jīng)手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者組織樣本62例,年齡40～72歲,中位年齡53.5歲,同時收集21例因子宮肌瘤行子宮內(nèi)膜切除術(shù)的正常子宮內(nèi)膜患者作為對照,年齡27～69歲,中位年齡52歲。所有樣本均通過術(shù)后病理組織切片確診,標(biāo)本置于-80 ℃保存。本研究通過南華大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(NHDX-20150509),所有研究對象均簽署知情同意書。

1.3引物設(shè)計(jì)、合成 根據(jù)GenBank 中的PTEN基因DNA序列(NC_000010.11),使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)PTEN基因968delA突變檢測引物,并對其3′末端進(jìn)行硫化修飾。公共上游引物GTCTTTGTGTTTACCTTTATTCAGA,野生型和突變型下游引物序列分別為TTTGCTTTGTCAAGATCATTTTTTGC和TTTGTCAAGATCATTTTTGTC,其中加粗斜體為硫化修飾堿基。引物由上海生工公司合成,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為349 bp。

1.4DNA提取 按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒的說明書提取基因組DNA,用MD2000D微量紫外分光光度計(jì)分別測定提取的DNA的濃度(≥5 ng/L)和純度(A260 nm/A280 nm為1.7～1.9),并置于-20 ℃保存。

1.5正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用 L9(34)正交設(shè)計(jì)表,以本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建的包含PTEN基因968delA位點(diǎn)的突變型質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒為模板,分別進(jìn)行高保真聚合酶介導(dǎo)的雙向引物延伸反應(yīng)。L9(34)設(shè)計(jì)方案以及影響PCR 反應(yīng)的各因素水平見表1。表1中的9次試驗(yàn)重復(fù)3次,PCR反應(yīng)體系為12.5 μL,除表1中所列因素外,用超純水補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,退火溫度梯度59～61 ℃,72 ℃延伸1 min;72 ℃終延伸5 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)30 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離,用凝膠成像儀掃描并拍照。參考何正文等[19]研究對結(jié)果進(jìn)行計(jì)算,根據(jù)擴(kuò)增條帶的強(qiáng)弱及雜帶的多少作1～9分計(jì)分,分?jǐn)?shù)越高表示PCR反應(yīng)的特異性越好。

表1 PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表[L9(34) ]

1.6PTEN基因PCR靈敏度試驗(yàn) 以10的倍數(shù)分別對968delA位點(diǎn)野生型和突變型重組質(zhì)粒模板進(jìn)行稀釋,將模板依次稀釋為10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7ng/μL,建立9個平行反應(yīng)體系,檢測已經(jīng)建立的突變敏感性分子開關(guān)的PCR靈敏度。

1.7臨床樣本初步應(yīng)用 在高保真DNA聚合酶的作用下,用優(yōu)化好的PCR反應(yīng)條件對21例正常子宮內(nèi)膜組織與60例子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本進(jìn)行分子開關(guān)的初步檢測應(yīng)用,根據(jù)瓊脂糖電泳結(jié)果判斷待測樣本是否含有PTEN基因968delA突變以及突變類型。

2 結(jié)果

2.1PTEN基因968delA突變檢測技術(shù)平臺的建立與優(yōu)化 參照表1各因素水平組成,分別進(jìn)行高保真聚合酶介導(dǎo)的雙向引物延伸反應(yīng),結(jié)果顯示:以野生型質(zhì)粒為模板時,968delA位點(diǎn)在4W/4M泳道目的條帶清晰,特異性好,分子開關(guān)現(xiàn)象最為明顯(圖1A),根據(jù)K值的大小得出的各因素優(yōu)化水平組合為:循環(huán)數(shù)為30 個、引物(10 μmol/L)為0.5或0.4 μL、模板DNA為0.3 μL、退火溫度為61 ℃。由R值可以得出各因素的重要性順序?yàn)?模板DNA(3)>引物(2.5)=退火溫度(2.5)>循環(huán)速(2),見表2。當(dāng)以突變性質(zhì)粒為模板時,4W/4M、5W/5M、7W/7M泳道特異性好,無雜帶,分子開關(guān)現(xiàn)象明顯(圖1B),根據(jù)K值的大小得出的各因素優(yōu)化水平組合為:循環(huán)數(shù)為30 個、引物為0.5 μL、模板DNA為0.4 μL、退火溫度為59 ℃。由R值可以得出各因素的重要性順序?yàn)?引物(4.167)>模板DNA(2.667)>退火溫度(1.167)>循環(huán)數(shù)為3(1),見表3。綜合分析后,確定適用于分子開關(guān)檢測PTEN基因968delA位點(diǎn)突變的最佳PCR反應(yīng)體系:循環(huán)數(shù)為30個、模板DNA(10 ng/μL)為0.3 μL、引物(10 μmol/L)為0.5 μL、退火溫度為61 ℃。

注:A,野生型質(zhì)粒模板;B,突變型質(zhì)粒模板;M,100 bp DNA Marker;1～9表示正交優(yōu)化后的9次試驗(yàn),1W～9W表示野生型引物,1M～9M表示突變型引物。圖1 PCR正交優(yōu)化瓊脂糖凝膠電泳圖

表2 野生型質(zhì)粒模板968delA位點(diǎn)正交試驗(yàn)結(jié)果記錄及分析

表3 突變型質(zhì)粒模板968delA位點(diǎn)正交試驗(yàn)結(jié)果記錄及分析

2.2PTEN基因968delA突變檢測技術(shù)平臺的靈敏度檢測結(jié)果 分別將突變型和野生型模板梯度稀釋后,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2,當(dāng)模板在10～10-3ng/μL時,目的條帶清晰可見,且無非特異性條帶。

注:A,野生型質(zhì)粒模板,B,突變型質(zhì)粒模板;M,100 bp DNA Ladder;1～9,模板濃度梯度分別為10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、10 ng/μL。圖2 各模板濃度梯度 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3PTEN基因968delA突變檢測技術(shù)平臺初步臨床應(yīng)用 用優(yōu)化好的PCR反應(yīng)體系對收集的21例正常子宮內(nèi)膜組織與62例子宮內(nèi)膜癌組織樣本進(jìn)行檢測,結(jié)果均發(fā)現(xiàn)只有野生型引物產(chǎn)生了特異性條帶,突變型引物均未產(chǎn)生特異性條帶(圖3A);測序結(jié)果進(jìn)一步確證樣本均未發(fā)生968delA位點(diǎn)突變(圖3B)。

注:A,分子開關(guān)檢測部分子宮內(nèi)膜組織樣本PTEN基因968delA位點(diǎn)凝膠電泳圖; B,子宮內(nèi)膜組織樣本測序圖;M,100 bp DNA Ladder;1～2,正常子宮內(nèi)膜組織;3～9,子宮內(nèi)膜癌組織;1W～9W,野生型特異性檢測引物;1M～9M,突變型特異性檢測引物。圖3 分子開關(guān)檢測PTEN基因的凝膠電泳及測序結(jié)果

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是全球范圍內(nèi)女性生殖系統(tǒng)子宮內(nèi)膜的常見多發(fā)上皮性惡性腫瘤,PTEN基因突變不僅是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的重要致病因素[6-7],同時也是有助于早期子宮內(nèi)膜癌患者保留生育治療決策的生物分子和遺傳預(yù)后因素[8-9]。本研究利用高保真酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)快速篩查點(diǎn)突變的技術(shù)平臺[10],根據(jù)影響PCR的重要因素制定了合理的正交設(shè)計(jì)方案,從循環(huán)數(shù)、引物、模板 DNA和退火溫度這4個方面來進(jìn)行突變檢測平臺優(yōu)化,得出了同時適用于檢測PTEN基因968delA位點(diǎn)野生型和突變型的PCR反應(yīng)體系,循環(huán)數(shù)選擇30個、模板DNA(10 ng/μL)為0.3 μL、引物(10 μmol/L)為0.5 μL、退火溫度為61 ℃。隨后,對PCR反應(yīng)模板靈敏度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)968delA位點(diǎn)野生型和突變型重組質(zhì)粒模板濃度在10-3ng/μL 時,均有目的條帶,表明本研究建立的突變靈敏度分子開關(guān)的靈敏度達(dá)10-3ng/μL,因而該技術(shù)不僅可以用于組織標(biāo)本突變的檢測,也可以用于簡單方便取材的血液游離DNA的檢測。

本研究進(jìn)一步對優(yōu)化后的子宮內(nèi)膜癌PTEN基因968delA突變檢測技術(shù)平臺的臨床實(shí)用性進(jìn)行了初步探討,并對62例子宮內(nèi)膜癌組織和21例正常子宮內(nèi)膜組織樣本進(jìn)行了PTEN基因968delA位點(diǎn)突變檢測,均未發(fā)現(xiàn)突變,且測序結(jié)果也驗(yàn)證了這一檢測結(jié)果,表明優(yōu)化的PTEN基因968delA位點(diǎn)缺失突變檢測技術(shù)平臺可以用于臨床樣本的篩查,本研究的樣本中并未檢測到PTEN基因968delA位點(diǎn)缺失突變,這可能與樣本量有限且來源單一以及中國人不同的遺傳背景有關(guān)。

本研究成功建立了子宮內(nèi)膜癌PTEN基因968delA突變檢測技術(shù)平臺。但有限的樣本量可能影響對子宮內(nèi)膜癌PTEN基因968delA突變的檢出,后續(xù)筆者將繼續(xù)收集臨床子宮內(nèi)膜癌患者樣本進(jìn)一步檢測;也可以進(jìn)一步篩查PTEN基因的其他突變,并對其與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性進(jìn)行分析,為國內(nèi)研究PTEN基因突變的檢測提供臨床前研究基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。綜上所述,該平臺的靈敏度較高,可以進(jìn)一步用于血液樣本游離DNA的檢測以實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌早診斷與早治療,為促進(jìn)腫瘤基因診斷應(yīng)用于臨床醫(yī)療拓寬新視野,甚至可能成為提高臨床用藥敏感性的依據(jù)。