張鈺,王成,汪俊軍(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院&東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗科,南京 210002)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是起源于腎小管上皮的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,約占成人惡性腫瘤的3%,早期缺乏特異性癥狀,診斷主要依靠影像學(xué)檢查,約17%的患者在初診時存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1],5年生存率僅為12%[2],因此早期診斷、轉(zhuǎn)移風(fēng)險的預(yù)測、藥物靶點的研發(fā)對于RCC患者診治及預(yù)后至關(guān)重要。細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是一種由細(xì)胞釋放的脂質(zhì)雙層膜包裹的納米級囊泡,內(nèi)含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞因子、DNA、RNA及代謝產(chǎn)物等多種生物分子,可被特定的受體細(xì)胞攝取并發(fā)揮生理功能。EVs主要分為凋亡小體、外泌體和微囊泡3種亞群,這3種亞群直徑大小、表面標(biāo)志蛋白存在重疊,尚缺乏明確區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)[3]。大量研究證實,腫瘤患者EVs可攜帶特定生物分子,作為細(xì)胞間信號網(wǎng)絡(luò)的重要通信介質(zhì),參與細(xì)胞功能調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生發(fā)展以及機體免疫反應(yīng)等多種過程[4-5]。本文簡要介紹了RCC患者EVs特定分子的變化及其在RCC發(fā)生、發(fā)展中的作用,探討EVs對于RCC診斷、治療的臨床應(yīng)用價值及挑戰(zhàn)。

1 EVs及其內(nèi)容物作為RCC新型分子標(biāo)志物

EVs由細(xì)胞釋放,可反映起始細(xì)胞的類型,攜帶特定信息轉(zhuǎn)移到鄰近或遠(yuǎn)處細(xì)胞發(fā)揮功能,誘導(dǎo)受體細(xì)胞表型改變[2]。研究顯示,EVs在不同來源及生理病理條件下的內(nèi)容物成分、含量具有的特異性、物種間的保守性、穩(wěn)定性、高豐度都賦予其理想的腫瘤液體活檢標(biāo)志物的潛力[6]。目前,國內(nèi)外已有部分EVs及其內(nèi)容物作為RCC分子標(biāo)志物的研究,具體內(nèi)容見表1。

表1 EVs及其內(nèi)容物作為RCC分子標(biāo)志物

1.1EVs作為RCC診斷和分期的標(biāo)志物 研究發(fā)現(xiàn)[7],與對照細(xì)胞系(HK-2)相比,RCC細(xì)胞系(786-O)分泌的EVs中miR-150的表達水平上調(diào)了5.2倍,而miR-205則下調(diào)了10 000倍,提示EVs中miR-205、miR-150可作為RCC診斷的新型標(biāo)志物。同時,Zieren等[8]對不同RCC細(xì)胞系來源的EVs中的腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)和mRNA進行多組學(xué)分析,確定了多個候選分子標(biāo)志物,并證實其不但可以區(qū)分RCC和良性病變,還可以輔助判斷RCC亞型,臨床轉(zhuǎn)化潛力巨大。

然而,體外細(xì)胞模型并不能完全和實時反映腫瘤狀況,臨床標(biāo)本的篩查及驗證仍必不可少。有報道稱[9],與健康人對照相比,腎癌患者血漿EVs中miR-149-3p和miR-424-3p水平上調(diào),而miR-92a-1-5p明顯下調(diào),可以輔助診斷RCC。Zhang等[10]分析發(fā)現(xiàn),透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)患者血清EVs中miR-210和miR-1233的表達水平明顯高于對照組,且腫瘤切除術(shù)后其表達水平均顯著降低,對于RCC診斷和手術(shù)效果監(jiān)測具有重要價值。

此外,RCC患者血清EVs中miR-210水平還與患者的臨床預(yù)后相關(guān),且對于早期患者的診斷性能優(yōu)于血清miR-210[11]。同樣地,血清EVs miR-4525可作為晚期RCC患者潛在的診斷指標(biāo)[12]。除血液外,其他體液來源的EVs同樣具備RCC診斷潛能。Butz等[13]發(fā)現(xiàn)尿液EVs miR-126-3p與miR-449a或miR-34b-5p聯(lián)合應(yīng)用可顯著區(qū)分ccRCC患者和健康人對照。目前,盡管EVs內(nèi)容物作為RCC分子標(biāo)志物的研究大部分聚焦于miRNA,但也要認(rèn)識到EVs中的其他特定分子(蛋白質(zhì)、mRNA、DNA等)亦可用于RCC的輔助診斷[14-16]。上述研究均證實EVs及其內(nèi)容物有望成為RCC診斷及分期標(biāo)志物。

1.2EVs作為RCC轉(zhuǎn)移監(jiān)測的標(biāo)志物 RCC具有高度轉(zhuǎn)移傾向,已有學(xué)者通過細(xì)胞和動物實驗證實,RCC細(xì)胞系(786-O)釋放的EVs可通過轉(zhuǎn)運長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)進入相鄰非轉(zhuǎn)移傾向RCC細(xì)胞,提高非轉(zhuǎn)移RCC細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[17]。同時,ccRCC患者腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)中分離的CD103+EVs通過轉(zhuǎn)運miR-19b-3p至ccRCC細(xì)胞,靶向與細(xì)胞遷移密切相關(guān)的第 10號染色體磷酸酶和張力蛋白同源缺失性基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)的蛋白質(zhì)表達,CD103還能夠引導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞EVs靶向癌細(xì)胞和器官,使得ccRCC具備更高的肺轉(zhuǎn)移能力[18]。另外,RCC轉(zhuǎn)移患者血漿EVs中miR-301a-3p表達增加、miR-1293表達減少,可作為RCC轉(zhuǎn)移潛在指標(biāo)[19]。

EVs蛋白亦可監(jiān)測RCC轉(zhuǎn)移。Kawakami等[20]建立了夾心ELISA法以檢測血清EVs中的前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性RCC患者的血清EVs PMSA水平顯著高于非轉(zhuǎn)移患者,并可反映腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶血管新生情況,能實時監(jiān)測轉(zhuǎn)移性RCC。此外,EVs表面或內(nèi)容物可為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供靶向識別位點,并為研發(fā)預(yù)測RCC轉(zhuǎn)移標(biāo)志物和靶向治療策略提供理論依據(jù)。

1.3EVs作為RCC耐藥、預(yù)后判斷的標(biāo)志物 RCC患者預(yù)后與腫瘤的分期、分級、轉(zhuǎn)移及患者對治療藥物的敏感性等密切相關(guān)。評估患者對于藥物的敏感性,可以指導(dǎo)臨床合理化、個體化、精準(zhǔn)化用藥。Ras相關(guān)蛋白Rab-27B(ras-related protein Rab-27B,RAB27B)是參與EVs分泌的主要蛋白質(zhì)之一,已有研究[21]證實,該蛋白質(zhì)高表達與肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌的不良預(yù)后有關(guān),在舒尼替尼耐藥的腎癌細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)RAB27B呈顯著高表達。Dias等[22]發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)移性原位ccRCC患者相比,轉(zhuǎn)移性患者血漿EVs中基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase1,TIMP-1) mRNA水平更高,總生存率更低,提示EVs來源的TIMP-1mRNA是ccRCC潛在的預(yù)后標(biāo)志物。另外,Zhang等[23]還發(fā)現(xiàn),經(jīng)冷凍消融治療1 d后,小鼠血清來源的EVs中miR-126-3p、miR-17-5p和miR-21-3p迅速下降,反映活躍腫瘤數(shù)量,可用于評價腫瘤清除效果及動態(tài)監(jiān)測腫瘤負(fù)荷。

2 EVs在RCC發(fā)生、發(fā)展中的作用機制

多項研究證實[24-26],在病理情況下,EVs釋放及其內(nèi)容物的量和質(zhì)都會發(fā)生改變,參與RCC發(fā)生、發(fā)展及TME的調(diào)節(jié),在細(xì)胞增殖、遷移、耐藥、血管生成、免疫抑制等方面發(fā)揮重要作用。

2.1EVs參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表型 對于腫瘤本身,TME中不同細(xì)胞分泌的EVs內(nèi)容物通過改變RCC細(xì)胞表型以支持腫瘤生長。腎癌細(xì)胞來源的EVs中miR-9-5p可通過靶向SOCS4mRNA并抑制其表達,促進兩面神激酶—信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(janus kinase-signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)途徑中JAK和STAT因子的磷酸化,從而激活轉(zhuǎn)錄,促進RCC的增殖、侵襲[27]。

缺氧是RCC-TME的顯著特征之一,85%的ccRCC患者中存在由染色體丟失引起的Von Hippel-Lindau(VHL)基因失活,為最常見的基因改變[28]。EVs的釋放可由多種因素誘導(dǎo),包括缺氧、pH變化、損傷、輻射、血小板激活和應(yīng)激狀態(tài)等。一項體外細(xì)胞水平研究[29]發(fā)現(xiàn),急性缺氧可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放更多的EVs。不僅如此,另有文獻報道[30]缺氧誘導(dǎo)RCC細(xì)胞來源的EVs miR-155表達增加,能顯著抑制叉頭框蛋白O3(FOXO3)的激活,減輕細(xì)胞凋亡,促進腫瘤增殖和遷移?？梢?缺氧條件下,腎癌細(xì)胞釋放EVs的量和內(nèi)容物均會發(fā)生改變,調(diào)節(jié)受體細(xì)胞表型,推動RCC進程。然而,目前關(guān)于缺氧如何調(diào)節(jié)EVs產(chǎn)生、釋放、調(diào)控的機制仍未闡明。

腫瘤細(xì)胞對于化療藥物的固有或獲得性耐藥是RCC晚期患者預(yù)后不良的重要原因。研究[31]發(fā)現(xiàn),與舒尼替尼抵抗相關(guān)的LncRNA(lncRNA activated in RCC with sunitinib resistance,LncARSR)是舒尼替尼耐藥的ccRCC細(xì)胞中高豐度的基因,可通過EVs包裹和傳遞,被受體細(xì)胞攝取后通過競爭性結(jié)合miR-34和miR-449以提高AXL受體酪氨酸激酶和細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換因子的表達,將受體細(xì)胞的表型從舒尼替尼敏感轉(zhuǎn)為耐藥。此外,索拉非尼耐藥細(xì)胞系的EVs可被敏感細(xì)胞攝取,EVs內(nèi)miR-31-5p靶向抑制MutL同源物1(MutL homolog 1,MLH1)的表達,從而傳遞耐藥信息[32]。

2.2EVs參與調(diào)控TME EVs不僅可以靶向腫瘤本身,其介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)細(xì)胞之間的通訊重塑了TME,為癌癥的進展和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了有利的條件[33]。

代謝重編程和血管新生是RCC 2個重要表型,腫瘤新生血管運輸氧氣和營養(yǎng)物質(zhì),維持TME穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn),缺氧導(dǎo)致更多數(shù)量的高表達碳酸酐酶Ⅸ(carbonic anhydrase Ⅸ,CAⅨ)的EVs從低氧腎癌細(xì)胞中釋放,可增加人臍靜脈上皮細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達,促進微環(huán)境中血管生成[34]。同時,RCC細(xì)胞分泌的miR-150、miR-23a、miR-210、miR-135b、miR-494、miR-1246和miR-9等可通過EVs傳遞到內(nèi)皮細(xì)胞,促進血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)分泌[13,35]。

不僅是腫瘤細(xì)胞本身,TME內(nèi)非腫瘤細(xì)胞來源的EVs也能夠調(diào)節(jié)腫瘤表型。Qin等[2]研究發(fā)現(xiàn),腎間充質(zhì)干細(xì)胞來源的EVs可促進RCC細(xì)胞移植瘤小鼠腫瘤生長和血管生成。此外,EVs也參與了TME中的免疫抑制。CD105+CSC來源的EVs干擾T細(xì)胞的活化、阻滯單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞的分化[2]。從人腎癌細(xì)胞中分離的EVs表面高表達凋亡相關(guān)因子配體,可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡[35],使得機體免疫系統(tǒng)不能有效激活、識別并清除腫瘤細(xì)胞?？傊?EVs在RCC的發(fā)生及進展中意義重大,對于其在 RCC中病理、生理機制的探索,能進一步拓寬EVs應(yīng)用于臨床RCC的早期診斷、治療的新思路。

3 EVs介導(dǎo)RCC的治療前景

EVs作為細(xì)胞間信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要媒介,在腫瘤的診斷、治療及預(yù)后等方面有著極大的應(yīng)用前景[36]。已有臨床研究[37]將EVs作為肺癌、腎癌、胃癌、乳腺癌、直腸癌、膽囊癌、胰腺癌及前列腺癌等疾病的新興治療手段。

3.1EVs在RCC中的治療靶點 首先,直接抑制EVs的釋放可以阻斷EVs的促腫瘤作用[37],但鑒于EVs的釋放非腫瘤細(xì)胞獨有,正常細(xì)胞亦可分泌EVs并發(fā)揮生理功能。因此,如何在不影響生理EVs分泌的情況下特異性阻斷腫瘤細(xì)胞EVs生物發(fā)生及釋放值得研究。

其次,EVs對于腫瘤存在正向與負(fù)向調(diào)控,故而通過特異性抗腫瘤內(nèi)容物的轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)來抑制RCC進程是EVs應(yīng)用于腫瘤治療的另一途徑。例如,間充質(zhì)干細(xì)胞來源的EVs可攜帶miR-182,抑制VEGF-A表達,促進T細(xì)胞增殖和激活,抑制ccRCC的進展和體內(nèi)轉(zhuǎn)移[38]。

基于EVs本身的生物學(xué)特性和其在RCC發(fā)生、發(fā)展進程中的腫瘤功能性行為,EVs可用于RCC單獨或聯(lián)合治療,現(xiàn)今主要從以下方面進行研究:(1)使用藥物抑制促腫瘤進展的EVs的釋放;(2)靶向內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體等內(nèi)容物分選通路,調(diào)節(jié)EVs內(nèi)貨物的裝載;(3)阻止受體細(xì)胞攝取促腫瘤的EVs;(4)表達治療性藥物的EVs抑制腫瘤進展相關(guān)通路[36]等,對于EVs的認(rèn)識及應(yīng)用尚且粗淺,需要更多的臨床研究來驗證其可行性。

3.2EVs作為天然藥物載體 EVs的生理功能可以作為RCC分子標(biāo)志物和治療干預(yù)靶點,更重要的是,其本身的固有特性也被認(rèn)為是向特定細(xì)胞運送miRNA、藥物及其他分子的天然載體。EVs的膜結(jié)構(gòu)可有效地保護內(nèi)容物不被降解,由內(nèi)源性細(xì)胞產(chǎn)生、分泌,能夠跨越各種生物屏障,安全低毒、低免疫原性、生物相容性高,且表面蛋白具有靶向性[39],能夠裝載多種癌癥的藥物和免疫治療疫苗[37]。

除治療作用外,基于EVs的分子成像修飾技術(shù)也被用于監(jiān)測和評估EVs在體內(nèi)的生物分布,包括生物發(fā)光、熒光標(biāo)記、放射性粒子及磁共振成像技術(shù)等[40],使腫瘤在體內(nèi)全程可視化。

3.3EVs應(yīng)用技術(shù)現(xiàn)況 盡管理論依據(jù)充分,但由于EVs具有納米級體積、群體異質(zhì)性大等固有屬性,研究技術(shù)、模型尚存在不足,基于EVs的RCC治療從實驗室研究到臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化之間尚存在較大差距,大規(guī)模生產(chǎn)及分離純化EVs、適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件、鑒定最佳療效和運輸效率、安全性、減少脫靶效應(yīng)及提高EVs腫瘤靶向性和藥物負(fù)載效率等問題尤待解決[26]。

筆者著重討論 EVs的分離純化技術(shù),高回收率和高純度分離是基礎(chǔ)實驗和下游應(yīng)用的先決條件。目前常規(guī)用于分離EVs的方法,主要是基于沉降系數(shù)、尺寸大小、免疫親和捕獲和化學(xué)沉淀等原理。國際囊泡協(xié)會推薦差速離心法進行EVs的分離,產(chǎn)物純度高,但對設(shè)備要求高,回收率低、耗時長、操作繁瑣,且高速離心可能損害EVs結(jié)構(gòu)及內(nèi)容物完整性,影響后續(xù)實驗[41];尺寸排除色譜法根據(jù)不同粒徑的分子在色譜固定相中不同的保留時間而分離富集EVs,該方法操作相對簡易且成本較低,但純度較低;免疫親和捕獲主要是利用EVs表面特異性標(biāo)志物與對應(yīng)抗體結(jié)合,進而分離捕獲目標(biāo)。此法產(chǎn)物純度很高,但特異性抗體成本較高,不利于臨床大規(guī)模檢測;基于聚乙二醇競爭性結(jié)合的聚合物沉淀法被廣泛應(yīng)用于商品化試劑盒的開發(fā),具有快速簡單、設(shè)備要求低等優(yōu)點,但產(chǎn)物特異性差,很難排除復(fù)雜體液中密度、大小相似的雜質(zhì)蛋白的干擾[42]。近年來,集EVs 的分離、表征和檢測于一體的微流控分離平臺已成為發(fā)展的主流趨勢,此方法產(chǎn)率及自動化程度高,但技術(shù)尚未成熟[43]。

現(xiàn)階段研究分離EVs方法的選擇主要依據(jù)下游應(yīng)用,其純度不可避免受其他顆粒的影響,不同亞型EVs獨特的表達模式被平均化。隨著研究技術(shù)的進步,針對腎細(xì)胞癌來源的單一亞型,尤其是單個EV的蛋白質(zhì)組、基因組及代謝組等多組學(xué)特征進行分析[36],更有利于理解EVs的生物學(xué)特性及功能。

4 總結(jié)與展望

綜上所述,針對腫瘤來源的EVs內(nèi)容物相較于傳統(tǒng)的循環(huán)腫瘤標(biāo)志物,可更加直接、準(zhǔn)確反映病變部位的病理狀況,在RCC的診斷分期、轉(zhuǎn)移監(jiān)測、耐藥及預(yù)后的評估方面具有廣闊的應(yīng)用前景。但現(xiàn)階段相關(guān)研究仍有待完善,包括:(1)分離、純化EVs方法未標(biāo)準(zhǔn)化,結(jié)果間一致性較差;(2)現(xiàn)有EVs作為RCC分子標(biāo)志物的研究主要集中于ccRCC這一病理類型,缺乏其他病理類型的探討,結(jié)果相對片面;(3)部分研究僅在細(xì)胞實驗層面展開,缺少動物模型、臨床樣本的驗證,實際應(yīng)用價值存疑;(4)研究多為回顧性分析,入組病例數(shù)偏少,人群相對單一,缺少多中心、多種族、大數(shù)據(jù)的高質(zhì)量前瞻性研究;(5)TME復(fù)雜,EVs來源不明,無法精準(zhǔn)分離循環(huán)體液中特定細(xì)胞來源的EVs,其生物發(fā)生、細(xì)胞外空間動態(tài)、受體細(xì)胞攝取及EVs貨物分子功能的傳遞機制有待探索。

EVs的生物發(fā)生受到細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)與細(xì)胞外環(huán)境刺激的共同影響,不同亞型發(fā)生、分選、釋放機制是否存在一致性和可比性尚不明確。同時,EVs與周圍、細(xì)胞外基質(zhì)的交互作用,如何跨越生物屏障,體內(nèi)分布及代謝情況,如何避免被降解,有無細(xì)胞、器官的選擇性亦有待進一步闡明;此外,EVs被受體細(xì)胞識別、攝取的分子機制、受體細(xì)胞膜的組成在EVs與細(xì)胞靶向方面的正向和負(fù)向調(diào)控;不同亞型或內(nèi)化方式,內(nèi)容物進入細(xì)胞后發(fā)揮的功能和最終結(jié)局是否不同[44],這些問題都是今后研究的方向。

現(xiàn)有的研究模型主要為體外細(xì)胞模型,忽略了EVs與周圍細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)的交流,未來應(yīng)嘗試模擬整體的3D生理背景,考慮其空間、結(jié)構(gòu)安排及潛在的物理、化學(xué)等微環(huán)境參數(shù)。除此之外,更高的時間和空間分辨率的EVs可視化手段能夠幫助重現(xiàn)體內(nèi)實況,更透徹地理解RCC-TME中EVs的生物學(xué)功能,指導(dǎo)臨床轉(zhuǎn)化。