朱玉青,朱琳,黃明濤,胡平,沈彬,梁棟,許爭(zhēng)峰(.南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院&南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心,南京 0004;.南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 66)

線粒體是真核細(xì)胞中負(fù)責(zé)能量代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等重要功能的細(xì)胞器,擁有一套獨(dú)立于細(xì)胞核基因組的遺傳物質(zhì),即線粒體基因組(mtDNA)[1]。人線粒體基因組是1個(gè)長(zhǎng)度為16 569 bp的環(huán)狀雙鏈DNA分子,以多拷貝的形式存在于細(xì)胞中。mtDNA由于缺少DNA損傷修復(fù)系統(tǒng),故而較之細(xì)胞核基因組更易產(chǎn)生突變[2],并且mtDNA突變可通過母系遺傳的方式傳遞至子代中[3]。由于線粒體基因組上的致病性突變可導(dǎo)致多種嚴(yán)重的線粒體代謝相關(guān)遺傳性疾病[4],因此對(duì)全線粒體基因組的高通量測(cè)序在線粒體遺傳病的診斷和深入研究十分重要。但是,mtDNA突變往往具有異質(zhì)性[5],且在細(xì)胞核基因組中存在同源序列[6],上述特點(diǎn)給全線粒體基因組的特異性深度測(cè)序帶來了額外的困難。本研究旨在建立了一種基于線粒體分離技術(shù)的mtDNA文庫構(gòu)建和測(cè)序方法,以期實(shí)現(xiàn)特異性針對(duì)線粒體基因組的深度測(cè)序。

1 材料與方法

1.1主要儀器及試劑 Thermo ST16離心機(jī)(美國Thermo公司),Microfuge 20R 4 ℃離心機(jī)(德國Beckman公司),ABI Veriti PCR儀(美國ABI公司),CELDOC XR凝膠圖像分析儀(美國Bio-Rad公司),Qubit 3.0熒光計(jì)(美國Invitrogen公司),A63880 AMPure XP磁珠(德國Beckman公司)。Lymphoprep淋巴細(xì)胞分離液、SepMate離心管(加拿大Stemcell公司),NP40裂解液、Tween-20(美國Sigma-Aldrich公司),RSB裂解液[配制:500 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),100 μL 10 mmol/L NaCl,150 μL 3 mmol/L MgCl2,混勻后加ddH2O定容至50 mL],2×TD 緩沖液[配制:2 mL 20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6),1 mL 10 mmol/L MgCl2,20 mL mmol/L 20%二甲基甲酰胺(DMF),混勻后加ddH2O定容至100 mL],ExoV核酸外切酶(英國NEB公司),PCR擴(kuò)增試劑盒、Tn5轉(zhuǎn)座酶試劑盒、雙端測(cè)序標(biāo)簽(Index)文庫制備試劑盒(南京諾唯贊公司),DNA純化試劑盒(美國Zymo公司)。

1.2樣本收集、mtDNA獲取及分離純化 收集2022年于本院志愿體檢健康者的外周靜脈血樣本1 mL,室溫保存于EDTA-K2抗凝管中。在8 h內(nèi)采用SepMate離心管,按照Lymphoprep淋巴細(xì)胞分離液說明書分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。設(shè)置4個(gè)PBMC的裂解條件進(jìn)行分組:條件1為含5% NP40和1% Tween-20的RSB裂解液;條件2為含5% NP40,不含Tween-20的RSB裂解液;條件3為含1% NP40和1% Tween-20的RSB裂解液;條件4為含1% NP40,不含Tween-20的RSB裂解液。向PBMC中加入15 μL裂解液,冰上裂解3 min,4 ℃、12 000×g離心5 min,立即吸取9.5 μL上清液至新的1.5 mL EP管內(nèi)。根據(jù)ExoV核酸外切酶說明書操作,在上清液中加入1.2 μL緩沖液,1.2 μL ATP和1 μL ExoV,37 ℃反應(yīng)30 min, 70 ℃反應(yīng)30 min使ExoV滅活,即得到分離純化后的mtDNA。

1.3分離純化后mtDNA的純度驗(yàn)證 針對(duì)核基因組18S rRNA、28S rRNA基因和線粒體基因組m.8363及m.13513位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括分離純化后的mtDNA 2 μL,2×Taq Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.8 μL(引物濃度為10 μmol/L),加入ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR循環(huán)參數(shù):98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,63 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次;4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后,對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)是否可見相應(yīng)片段大小的條帶定性判斷模板DNA中有無核基因組DNA或線粒體基因組DNA。

表1 引物序列及產(chǎn)物片段大小

1.4建立全線粒體基因組測(cè)序文庫 在分離純化后的mtDNA中加入12.4 μL 2×TD 緩沖液,0.5 μL Tn5,70 ℃反應(yīng)30 min,將mtDNA片段化;使用DNA純化試劑盒對(duì)片段化mtDNA進(jìn)行純化,使用雙端測(cè)序Index文庫制備試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)加接頭引物,PCR體系為20 μL,包括純化后的mtDNA 6 μL,上、下游接頭引物各2 μL,5×TAB 5 μL,TAE 0.5 μL,加入ddH2O補(bǔ)足至20 μL;PCR循環(huán)參數(shù):98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,63 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)18次;4 ℃保存。對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2輪磁珠回收,取1 μL 回收產(chǎn)物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,若可見185～2 000 bp大小的彌散條帶則認(rèn)為得到合格測(cè)序子文庫。

1.5高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 使用Qubit 3.0熒光計(jì)測(cè)定子文庫的濃度,等量混合得到測(cè)序文庫。通過Illumina NovaSeq 6000測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序策略采用150 bp雙端測(cè)序法。測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)使用Trim galore、Bowtie2等生物信息學(xué)軟件完成序列分析和比對(duì),通過GATK標(biāo)準(zhǔn)化線粒體基因組SNP/Indel變異檢測(cè)流程進(jìn)行變異位點(diǎn)分析。設(shè)置質(zhì)量控制參數(shù)包括:每個(gè)樣本數(shù)據(jù)產(chǎn)出量(Clean bases數(shù))>0.4 G,堿基質(zhì)量值Q30>80,線粒體reads數(shù)占比>20%,平均測(cè)序深度>5 000×。

1.6Sanger測(cè)序 針對(duì)樣本4 m.10559A>G、m.10398A>G、m.10400C>T位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,引物序列見表1。 PCR體系為50 μL,包括DNA模板2 μL,2×Taq Master Mix 25 μL,10 μmol/L上、下游引物各2 μL,加入ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR循環(huán)參數(shù):98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,63 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)30次;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送上海華大公司測(cè)序驗(yàn)證,Sanger測(cè)序試劑及儀器由美國 Applied Biosystems 公司提供。

2 結(jié)果

2.1mtDNA分離純化的最優(yōu)條件及測(cè)序結(jié)果 對(duì)本研究設(shè)置的4個(gè)分離純化mtDNA的條件進(jìn)行驗(yàn)證,電泳結(jié)果顯示,陽性對(duì)照4條泳道全部擴(kuò)增出,陰性對(duì)照4條泳道均未擴(kuò)增出;條件1～3經(jīng)PCR 擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)后,除擴(kuò)增出線粒體基因組外,仍額外擴(kuò)增出核基因組18S rRNA、28S rRNA;而條件4僅擴(kuò)增出線粒體基因組(圖1)。

注:瓊脂糖凝膠電泳對(duì)分離純化后mtDNA純度的驗(yàn)證,其中條件1為5% NP40+1% Tween-20;條件2為5% NP40,不含Tween-20;條件3為1% NP40+1% Tween-20;條件4為1% NP40,不含Tween-20;陽性對(duì)照模板為全基因組DNA,陰性對(duì)照未加模板;泳道1,核基因組18S rRNA;泳道2,核基因組28S rRNA;泳道3,線粒體基因組m.8363位點(diǎn);泳道4,線粒體基因組m.13513位點(diǎn)。圖1 對(duì)分離純化后mtDNA純度的電泳驗(yàn)證結(jié)果

在條件4下,對(duì)6例PBMC建庫樣本進(jìn)行mtDNA文庫構(gòu)建及深度測(cè)序,結(jié)果顯示6例樣本測(cè)序結(jié)果中,數(shù)據(jù)產(chǎn)出量最低可達(dá)0.45 G,堿基質(zhì)量值Q30均在85以上,mtDNA reads數(shù)占比最高可達(dá)92%,平均測(cè)序深度最高超過20 000×(表2)。

表2 6例PBMC建庫樣本測(cè)序結(jié)果

2.2同質(zhì)性和異質(zhì)性變異位點(diǎn)的驗(yàn)證結(jié)果 對(duì)6例樣本的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)分析,每例樣本均可檢出若干同質(zhì)性變異(表3、表4),其中樣本4檢出1個(gè)異質(zhì)性變異(m.10559A>G,突變率為17%),經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證,該樣本確實(shí)存在相應(yīng)的異質(zhì)性變異。同時(shí),針對(duì)該樣本選取數(shù)個(gè)同質(zhì)性變異位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證,結(jié)果均可檢出相應(yīng)變異(圖2)。

注:A,m.10559A>G為異質(zhì)性變異,異質(zhì)度為17%;B,Sanger測(cè)序顯示m.10559A>G為異質(zhì)性變異;C,m.8701A>G為同質(zhì)性變異;D,Sanger測(cè)序顯示m.8701A>G為同質(zhì)性變異;E,m.10398A>G為同質(zhì)性變異;F,Sanger測(cè)序顯示m.10398A>G為同質(zhì)性變異;G,10400C>T為同質(zhì)性變異;H,Sanger測(cè)序顯示m.10400C>T為同質(zhì)性變異。圖2 Sanger測(cè)序驗(yàn)證樣本4中的變異位點(diǎn)

表3 1～3號(hào)建庫樣本所有同質(zhì)性和異質(zhì)性變異

表4 4～6號(hào)建庫樣本所有同質(zhì)性和異質(zhì)性變異

3 討論

本研究創(chuàng)新性地構(gòu)建了一種基于線粒體分離純化的全線粒體基因組深度測(cè)序方法,并通過核質(zhì)分離的方式來實(shí)現(xiàn)非PCR富集mtDNA。通過擴(kuò)增核基因組18S rRNA、28S rRNA以及線粒體基因組m.8363和m.13513位點(diǎn)檢測(cè)mtDNA分離后的純度,證明本方法可獲得較高純度的mtDNA,有效避免了文庫中出現(xiàn)細(xì)胞核DNA及“核線粒體同源序列”的干擾;通過Sanger測(cè)序,筆者進(jìn)一步驗(yàn)證了本方法所檢出的同質(zhì)性變異和異質(zhì)性變異的準(zhǔn)確性,表明構(gòu)建的深度測(cè)序方法結(jié)果準(zhǔn)確可信。然而,本方法仍存在一定局限性:在核質(zhì)分離時(shí)需要保證細(xì)胞核的完整,因此,檢測(cè)時(shí)需要使用采血8 h內(nèi)的新鮮外周血,而不可使用凍存的血細(xì)胞樣本。此外,在受檢樣本類型為非外周血細(xì)胞時(shí)(如尿液細(xì)胞、肌肉組織、腫瘤組織等),本方法的有效性尚不明確,需在后續(xù)工作中展開進(jìn)一步研究,以獲得相應(yīng)結(jié)論。

線粒體是真核生物細(xì)胞中最重要的細(xì)胞器之一,其攜帶的線粒體基因組具有多拷貝、易突變等特征,對(duì)線粒體發(fā)揮正常生理功能至關(guān)重要。因此,獲得高質(zhì)量的mtDNA序列信息在臨床和科研中具有重要價(jià)值。傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序方法是針對(duì)特定位點(diǎn)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[7],但受測(cè)序長(zhǎng)度限制,Sanger測(cè)序很難應(yīng)用于全線粒體基因組測(cè)序,且無法分辨低異質(zhì)度的變異位點(diǎn)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)[8]的出現(xiàn),對(duì)全線粒體基因組進(jìn)行深度測(cè)序已成為獲得mtDNA序列信息的最優(yōu)方法。目前,主流的全線粒體基因組高通量測(cè)序策略包括全基因組測(cè)序策略和mtDNA富集策略。全基因組測(cè)序策略通過篩選、拼裝全基因組測(cè)序[9]或外顯子測(cè)序[10]的數(shù)據(jù)中比對(duì)線粒體基因組上的reads,獲得全線粒體基因組的序列信息,但是該策略成本較高,難以大規(guī)模應(yīng)用,且測(cè)序結(jié)果難以排除核基因組同源序列的干擾。mtDNA富集策略主要包括長(zhǎng)片段PCR富集法和特異性探針捕獲法。長(zhǎng)片段PCR富集法[11]通過兩對(duì)或多對(duì)引物擴(kuò)增全線粒體基因組,再將擴(kuò)增得到的長(zhǎng)片段mtDNA打斷進(jìn)行深度測(cè)序,這種方法可以對(duì)全線粒體基因組進(jìn)行深度測(cè)序,但是同樣受到潛在的核基因組同源序列干擾。此外,長(zhǎng)片段PCR經(jīng)常存在擴(kuò)增失敗的情況,而PCR本身存在的偏好性也會(huì)對(duì)異質(zhì)性變異的測(cè)序結(jié)果造成影響。特異性探針捕獲法[12]需要設(shè)計(jì)大量與mtDNA互補(bǔ)的寡核苷酸探針,通過PCR加接頭引物來富集mtDNA片段進(jìn)行深度測(cè)序,此方法相對(duì)復(fù)雜,且同樣無法避免核基因組同源序列的干擾。相比于以上方法的優(yōu)缺點(diǎn),本研究創(chuàng)新性地構(gòu)建了一種基于線粒體分離純化技術(shù)的全線粒體基因組深度測(cè)序的方法,通過核質(zhì)分離,可有效獲得mtDNA特異性文庫。本方法整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程通過非PCR的方式來富集mtDNA,避免了PCR的偏好性對(duì)測(cè)序結(jié)果的影響,且可以避免核基因組同源序列的干擾。在具體實(shí)驗(yàn)操作上,本方法大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程,較其他mtDNA高通量測(cè)序方案耗時(shí)短,reads利用率高,建庫成本較低,可以應(yīng)用于大規(guī)模人群mtDNA的測(cè)序工作。

目前線粒體疾病(mitochondrial diseases,MD)的診斷仍具有很大的挑戰(zhàn)性。雖然一些MD具有明確的臨床癥狀,容易識(shí)別,如慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹(chronic progressive external ophthalmoplegia,CPEO)[13]、線粒體腦肌病合并乳酸酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作(mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes,MELAS)[14]等,但更多的患者不會(huì)表現(xiàn)出疾病的典型癥狀和體征。MD的實(shí)驗(yàn)室診斷多數(shù)是通過對(duì)疾病受累的組織或器官進(jìn)行生物化學(xué)(如測(cè)定線粒體ATP酶的活性)等方法來診斷,最終確診常需要侵入性活檢,耗時(shí)長(zhǎng)且不易被患者接受。迄今為止,研究者已發(fā)現(xiàn)了300多個(gè)基因的致病性突變可導(dǎo)致MD[15],Mitomap數(shù)據(jù)庫也給出96個(gè)明確致病的mtDNA突變位點(diǎn)。當(dāng)患者臨床癥狀為多系統(tǒng)受累或綜合征表現(xiàn)時(shí),需要高度懷疑MD,則應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行基因檢測(cè)[16]。對(duì)于MD的遺傳學(xué)病因診斷,本方法由于建庫實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)易、成本低、準(zhǔn)確性高,相較于其他測(cè)序方法具有較大優(yōu)勢(shì),可用于研究MD患者的致病機(jī)制,發(fā)現(xiàn)潛在性MD患者,同時(shí)也可以指導(dǎo)臨床醫(yī)生給予患者精確的遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷等方面的幫助。

綜上所述,本研究開發(fā)了一種基于線粒體分離純化技術(shù)的mtDNA建庫及測(cè)序方法,可實(shí)現(xiàn)特異性全線粒體基因組深度測(cè)序。本研究通過非PCR的方法獲得較純的mtDNA文庫,不易受核基因組同源序列干擾,可準(zhǔn)確且靈敏地檢出線粒體基因組的同質(zhì)性和異質(zhì)性變異。此外,本方法可較好地應(yīng)用于PBMC樣本,適合在臨床上推廣和應(yīng)用。