伊日貴，高強(qiáng)，劉丹，聶苗苗，晁燕，張存芳，祁得林*，朱世海

（1.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，西寧 810016；2.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，西寧 810016；3.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)系，西寧 810016）

高原鰍屬Triplophysa隸屬于鯉形目Cypriniformes 條鰍科Nemacheilidae，廣泛分布于青藏高原及其毗鄰地區(qū)，是適應(yīng)青藏高原寒冷、缺氧等氣候特征的特殊類群（朱松泉，1989；武云飛，吳翠珍，1992；Prokofiev，2001）。約有150 種有效種被描述，有證據(jù)表明高原鰍屬具有豐富的物種多樣性，許多物種尚未被識別或描述（何春林等，2011）。

黃河上游高原鰍復(fù)合體是指由同域分布的、幼魚階段無法從形態(tài)特征分辨的高原鰍屬魚類組成。資料表明，黃河上游干流及支流湟水河流域主要分布有擬硬刺高原鰍T.pseudoscleroptera、硬刺高原鰍T.scleroptera、東方高原鰍T.orientalis、隆頭高原鰍T.alticeps、斯氏高原鰍T.stoliczkae、粗壯高原鰍T.robusta、擬鯰高原鰍T.siluroides和黃河高原鰍T.pappenheimi等（武云飛，吳翠珍，1992）。在黃河上游高原鰍復(fù)合體中，硬刺高原鰍成體因背部和體側(cè)上部具有黑褐色細(xì)斑紋，擬鯰高原鰍成體因頭部和軀干寬闊而扁平，粗壯高原鰍因前軀呈圓筒形、背部在背鰭前后各有4～5 塊深褐色斑塊，隆頭高原鰍成體因頭背部高隆等典型特征而易于鑒定和區(qū)分，但其他高原鰍因形態(tài)特征不具典型性或因表型可塑性（或趨同進(jìn)化），難以鑒定和區(qū)分（何春林等，2011）。更重要的是，在野外資源調(diào)查和物種多樣性調(diào)研時，往往會采集到大量幼魚，這些正值發(fā)育階段的魚類因不具典型特征而無法從形態(tài)進(jìn)行分類和分析，為物種多樣性和資源量的客觀評估帶來了一定的困難。

mtDNA 是研究分子系統(tǒng)學(xué)、生物地理學(xué)和親緣物種遺傳多樣性的理想分子標(biāo)記。在mtDNA 的13 個蛋白編碼基因中，cyt b的結(jié)構(gòu)和功能較清楚，且能用通用引物快速擴(kuò)增，在不同科、屬、種的研究中表現(xiàn)出明顯的遺傳差異（Guoet al.，2005），因此被廣泛用于高原魚類物種鑒定、分子進(jìn)化、系統(tǒng)地理學(xué)和遺傳結(jié)構(gòu)研究（何德奎等，2006；Qiet al.，2007，2015；馮晨光，2018；Fenget al.，2019）。截止目前，針對黃河上游干流及支流湟水河流域高原鰍DNA 條形碼和分子鑒定等方面的研究仍然滯后。本研究通過黃河上游干流及支流湟水河流域高原鰍樣本的采集，利用cyt b基因標(biāo)記開展分子鑒定，以期為黃河上游干流及支流湟水河流域的高原鰍物種分類、組成研究提供科學(xué)依據(jù)，為該地區(qū)高原鰍物種多樣性的保護(hù)奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

高原鰍樣本共95尾，采集于黃河上游干流及支流湟水河流域（表1）。野外采樣時，取肌肉（成體）或幼體整體75%無水乙醇固定后，-80 ℃保存。

表1 樣本采集信息Table 1 Sampling information of Triplophysa complex

1.2 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

1.2.1 DNA 提取 取樣本肌肉組織約30 mg，將組織剪碎后用ddH2O 處理為細(xì)胞懸液（處理2 次），按照動物組織基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）操作說明提取樣本基因組總DNA，使用NanoDrop 2000 超微量分光光度計進(jìn)行DNA濃度和純度檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性，-20 ℃保存。

1.2.2cyt b基因片段擴(kuò)增及測序 采用PCR 和通用引物L(fēng)14724（5’-GACTTGAAAAACCACCGTT G-3’）和H15915（5’-CTCCGATCTCCGGATTACAA GAC-3’）（Xiaoet al.，2001）對mtDNAcytb基因全序列進(jìn)行擴(kuò)增。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用20 μL 的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：1 μL 基因組總DNA，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix Ⅱ，Primer F/R 各1 μL（10 mmol·L-1），加ddH2O 至總體積20 μL；PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃4 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將合格的PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用Clustal X（Larkinet al.，2007）和DNA STAR（Burland，2000）的Editseq 比對序列。采用DnaSP6（Rozaset al.，2003）分析單倍型數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)、平均核苷酸差異數(shù)，并計算序列保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)和簡約信息位點(diǎn)。采用MEGA 11（Tamuraet al.，2021）統(tǒng)計基因序列堿基組成、序列間的堿基變異頻率和序列間的轉(zhuǎn)換、顛換頻率和轉(zhuǎn)換顛換比。利用BLAST 在NCBI 對單倍型進(jìn)行同源比對，并下載相似度高的序列：擬硬刺高原鰍（KX373844.1、MG697585.1）、硬刺高原鰍（KX373840.1）、麻爾柯河高原鰍T.markehenensis（MG725416.1）、東方高原鰍（MG725414.1）、隆頭高原鰍（KX373837.1）、斯氏高原鰍（MG725382.1）、粗壯高原鰍（MG697581.1）、擬鯰高原鰍（MG697471.1、MG697474.1）和黃河高原鰍（MG697453.1）。利用PhyloSuite（Zhanget al.，2020）、IQtree v1.6.12（Nguyenet al.，2015）和MEGA 11 分別基于貝葉斯（BI）法、最大似然（ML）法和鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以葉爾羌高原鰍T.yarkandensis（GenBank 登錄號：KX373836.1、KT224367.1）為外群。構(gòu)建BI 樹時，4 條馬爾科夫鏈同時運(yùn)行1×106代，通過后驗概率評估每個節(jié)點(diǎn)，每100代對系統(tǒng)樹抽樣；構(gòu)建ML 樹時，利用ModelFinder 選擇最佳核苷酸替換模型（GTR+F+I），并采用啟發(fā)式搜索算法；NJ 樹采用K2P 雙參數(shù)模型，重復(fù)取樣次數(shù)為1 000。將所有單倍型提交到ABGD 網(wǎng)站（https：//bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/abgdweb.html），選擇K2P 模型，P 設(shè)為0.001～0.01，X 設(shè)為1.5，其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。最后利用MEGA 11 計算基于K2P雙參數(shù)模型的遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 cyt b基因的堿基組成及序列變異分析

95 尾個體均獲得cyt b基因序列全長，長度為1 140 bp，所測cytb基因序列中未發(fā)現(xiàn)堿基的插入或缺失。經(jīng)檢測，95 條cyt b基因序列隸屬于46 個單倍型，所有序列均已提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫（登錄號：OP616066～OP616111）。在46個單倍型的1 140 個位點(diǎn)中共存在317 個變異位點(diǎn)，約占27.8%。其中，單一突變位點(diǎn)50 個、簡約信息位點(diǎn)267個（23.4%）。單倍型多樣性為0.958，核苷酸多樣性為0.092。cytb基因序列的A、T、G 和C堿基平均含量分別為25.9%、30.9%、16.5%和26.6%，其中A+T 含量56.8%，明顯高于G+C 含量（43.1%），G 含量最低，表現(xiàn)出明顯的反G 偏倚性，與其他硬骨魚類cyt b基因堿基組成的基本特征一致（祁得林等，2009）；且cyt b基因第一密碼子的GC 平均含量為50.0%，第二和第三密碼子的平均含量分別為38.6%和39.8%；轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和顛換位點(diǎn)總數(shù)分別為86 個和19 個，堿基變異均勻的分布于該序列的各個區(qū)域，但有明顯的密碼子偏倚，第3 密碼子的轉(zhuǎn)換和顛換位點(diǎn)最多，分別為73 個和17 個，堿基轉(zhuǎn)換與顛換的比值為4.2，轉(zhuǎn)換明顯多于顛換。

2.2 高原鰍復(fù)合體的分子鑒定

2.2.1 基于BLAST 比對的物種鑒定 46 個單倍型與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的參考序列具有較高相似度（97.63%～100.00%），涉及高原鰍屬魚類9 個物種。15 個單倍型（H32～46）與擬硬刺高原鰍、硬刺高原鰍、麻爾柯河高原鰍3 個物種序列高度相似；8個單倍型（H23～29、31）與東方高原鰍序列高度相似；5個單倍型（H10～14）與隆頭高原鰍序列高度相似；7 個單倍型（H3～9）與斯氏高原鰍序列高度相似；1個單倍型（H30）與粗壯高原鰍序列高度相似；10 個單倍型（H1～2、H15～22）與擬鯰高原鰍、黃河高原鰍序列高度相似（表2）。

表2 高原鰍復(fù)合體cyt b基因的采樣編號、單倍型及BLAST比對結(jié)果Table 2 Sample number，haplotype and BLAST results of cyt b gene of Triplophysa complex

2.2.2 基于cytb基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹的物種鑒定以葉爾羌高原鰍的2條序列為外群，結(jié)合本研究所有單倍型序列，采用BI、ML 和NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，3 種系統(tǒng)發(fā)育分析方法得到拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)高度一致的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。待鑒別的所有樣本單倍型序列與其近緣種共聚為8 個明顯的獨(dú)立單系群（A～H），但個別聚類支如A 支和H 支的支持率不高。其中，高原鰍復(fù)合體的11 個單倍型（H36～46）與擬硬刺高原鰍和麻爾柯河高原鰍的已知序列聚為一個單系群A，4 個單倍型（H32～35）與硬刺高原鰍的序列聚為一支B，8個單倍型（H23～29、H31）與東方高原鰍已知序列組成為單系群C，5 個單倍型（H10～14）與隆頭高原鰍已知序列聚為單系群D，7 個單倍型（H3～9）與斯氏高原鰍已知序列聚為單系群E，1 個單倍型（H30）與粗壯高原鰍已知序列聚為1 個單系群F，3 個單倍型（H2、H21～22）與黃河高原鰍已知序列形成1 個單系群G，其余7 個單倍型（H1、H15～H20）與擬鯰高原鰍2 條已知序列表現(xiàn)出高度的序列同源性，聚在同一支上（H）。

圖1 利用鄰接法構(gòu)建的高原鰍復(fù)合體cyt b序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on mitochondrial cyt b sequence for Triplophysa complex

2.2.3 ABGD 劃分 利用ABGD 網(wǎng)站對高原鰍復(fù)合體的46 個單倍型序列和GenBank 數(shù)據(jù)庫下載的已知同源序列進(jìn)行進(jìn)一步的劃分檢驗，結(jié)果包括原始劃分和遞歸劃分。其中，原始劃分把46 個單倍型和已知同源序列劃為6 組，劃分結(jié)果較穩(wěn)定，而遞歸劃分把46個單倍型和已知同源序列劃分為7～8 組，劃分結(jié)果有波動。因此，選擇較穩(wěn)定的原始劃分為參考，在P 為0.001～0.01 的范圍內(nèi)，自動檢測出6 組，ABGD 劃分結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果在ABGD1和ABGD6出現(xiàn)偏差（圖2）。

圖2 ABGD軟件對高原鰍復(fù)合體的劃分結(jié)果Fig.2 Automatic partition results of Triplophysa complex based on ABGD

2.2.4 種間、種內(nèi)遺傳距離分析 采用K2P 雙參數(shù)模型統(tǒng)計高原鰍復(fù)合體的種內(nèi)、種間的遺傳距離（表3）：種內(nèi)遺傳距離為0.000 6～0.019 2（平均為0.004 4），種間遺傳距離為0.005 1～0.159 8（平均為0.105 6）。系統(tǒng)發(fā)育樹上顯示的A、B 支的單倍型之間和G、H 支的單倍型之間具有較低的遺傳距離（0.005 1、0.005 3），同時A 支和B 支與已知擬硬刺高原鰍、麻爾柯河高原鰍、硬刺高原鰍序列間遺傳距離很低（0.002 3、0.001 8、0.004 2和0.004 8、0.003 5、0.000 9）；同樣，G 支和H 支與同源序列擬鯰高原鰍、黃河高原鰍也提示為種內(nèi)距離標(biāo)準(zhǔn)（0.000 6、0.004 6和0.004 8、0.002 5）。

表3 高原鰍復(fù)合體基于cyt b基因序列的種內(nèi)、種間遺傳距離Table 3 Genetic distance within-species and between-species of Triplophysa complex based on cyt b gene sequences

3 討論

3.1 cyt b 基因用于高原鰍屬魚類物種鑒定的有效性

mtDNA 在進(jìn)化中表現(xiàn)為選擇中性，能夠解決由于趨同進(jìn)化、可塑性引起的傳統(tǒng)形態(tài)分類方法難以界定的物種鑒定（Xiaoet al.，2001；Qiet al.，2015；Fenget al.，2019）。以往動物cyt b基因研究表明，遺傳距離超過6%的個體間已有明顯的亞種或種的分化（楊學(xué)干等，2001；Yanget al.，2002；王義權(quán)等，2004）。裂腹魚亞科Schizothoracinae 魚類的研究顯示，各指名種間基于cyt b基因序列的遺傳距離在1.33%～9.80%，種間平均遺傳距離明顯低于6%，這可能與高原魚類因青藏高原快速隆升所致的物種分化較晚有關(guān)（祁得林等，2006）。本研究中，綜合BLAST 同源比對、系統(tǒng)發(fā)育分析和ABGD 劃分結(jié)果顯示，盡管利用cyt b基因無法完全厘清ABGD1組和ABGD6組的物種，但大部分物種能夠準(zhǔn)確鑒定，且被鑒定的物種間平均遺傳距離（0.105 6）是種內(nèi)遺傳距離（0.004 4）的24 倍，符合Hebert 等（2004）提出的“10×規(guī)則”。因此，利用cyt b基因進(jìn)行高原鰍屬魚類物種鑒定是可行的。

3.2 黃河上游高原鰍復(fù)合體的物種組成

種內(nèi)、種間遺傳距離是進(jìn)行物種鑒別的主要標(biāo)準(zhǔn)（周建設(shè)等，2019）。本研究結(jié)合遺傳距離結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，進(jìn)一步證實(shí)單系群C中的8 個單倍型（H23～29、H31）與相應(yīng)已知序列（東方高原鰍）的遺傳距離為0.007 3，單系群D 的5 個單倍型（H10～14）與已知序列（隆頭高原鰍）的遺傳距離為0.019 2，單系群E 中的7 個單倍型（H3～9）與已知序列（斯氏高原鰍）的遺傳距離為0.001 3，單系群F 的1 個單倍型（H30）與已知序列（粗壯高原鰍）的遺傳距離為0.000 9，均能夠明顯呈現(xiàn)出種內(nèi)個體間遺傳距離水平（Hellberget al.，2014），由此可確定單系支C 的8 個單倍型（H23～29、H31）隸屬于東方高原鰍，單系支D 的5 個單倍型（H10～14）屬于隆頭高原鰍，單系支E中的7個單倍型（H3～9）為斯氏高原鰍，單系支F的1個單倍型（H30）為粗壯高原鰍。這些單系群之間的平均遺傳距離為0.117 9，符合種間水平。在所采集樣本中，X3、X19 和X22 接近成體發(fā)育階段，X3 具有粗壯高原鰍的典型特征，而X19和X22具有隆頭高原鰍的典型特征，這與本研究中基于cyt b基因序列的物種鑒定相符。

資料表明（武云飛，吳翠珍，1992），麻爾柯河高原鰍僅分布在大渡河流域，鑒于本次樣本來自于黃河流域，因此麻爾柯河高原鰍可以從ABGD1組中排除。硬刺高原鰍和擬硬刺高原鰍在腸道和鰾后室結(jié)構(gòu)上存在明顯差異，且擬硬刺高原鰍的背鰭最后1 根不分枝鰭條的粗硬部分少于硬刺高原鰍（武云飛，吳翠珍，1992）。成體階段，硬刺高原鰍因背部和體側(cè)上部具有黑褐色細(xì)斑紋而容易區(qū)分，如本研究中L5 和L16 均為成體，被鑒定為硬刺高原鰍，但在幼魚階段，這2 個物種很難區(qū)分。鑒于，單系群A 的11 個單倍型（H36～46）與其聚為一個支的擬硬刺高原鰍的遺傳距離（0.002 3）、以及與硬刺高原鰍的遺傳距離（0.001 8）很低，加之這2個物種在黃河上游廣泛分布（武云飛，吳翠珍，1992），本研究認(rèn)為ABGD1 組可能是：由1 個物種組成，應(yīng)將早期形態(tài)學(xué)分類中的硬刺高原鰍和擬硬刺高原鰍合并為硬刺高原鰍；由2個形態(tài)模糊種組成，但在今后的工作中需要結(jié)合分子手段和傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)進(jìn)一步厘清分類學(xué)地位。

對于ABGD6 組而言，樣本X15、X16 和W15 均為成體，具有擬鯰高原鰍頭部和軀干寬闊而扁平的典型特征，7 個單倍型（H1、H15～H20）可進(jìn)一步明確為擬鯰高原鰍。黃河高原鰍支中H2、H21 和H22 樣品均為幼體，采樣時無法從形態(tài)學(xué)鑒定物種，但這3個單倍型與黃河高原鰍和擬鯰高原鰍序列的遺傳距離分別為0.000 6 和0.004 6，均顯示出種內(nèi)水平。黃河高原鰍頭部特征與擬鯰高原鰍趨同，具有扁平的特征，但是黃河高原鰍成體軀干呈圓筒狀，因此，在幼魚至成體發(fā)育的過渡階段兩者的物種鑒定容易出現(xiàn)偏差。本研究認(rèn)為GenBank中黃河高原鰍序列MG697453.1 可能屬于這種情況，實(shí)質(zhì)上應(yīng)該是擬鯰高原鰍。

高原鰍屬魚類在外形特征等方面表現(xiàn)出相似性，尤其是在幼魚階段很難用傳統(tǒng)的分類學(xué)方法進(jìn)行鑒定，這可能與同域分布物種的趨同進(jìn)化有關(guān)（Muschicket al.，2011；Qiet al.，2012）。無論如何，利用cyt b基因序列進(jìn)行黃河上游高原鰍復(fù)合體進(jìn)行分子鑒定，在一定程度上是可行的。本研究在黃河上游干流及支流湟水河流域5 個采樣點(diǎn)共95 個樣本中至少共鑒定到6 個物種，但cyt b基因作為核外遺傳物質(zhì)，其信息量有限，特別是在近緣物種的分類研究中要慎重對待。