熊彬,張思艷,孟奇,魏亮,姜守剛

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150040;2.東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

腸癌不僅為高發(fā)癌癥之一,并且被發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期,手術(shù)難度較大,故化療成了治療的主要方式[1-3]。近年來(lái),老藥新用成為越來(lái)越熱門(mén)的話(huà)題。雙硫侖,又名戒酒硫,臨床主要用于臨床治療酒精依賴(lài)癥,現(xiàn)在越來(lái)越多的研究證實(shí)雙硫侖(DSF)具有廣譜抗腫瘤活性,并且在抗腸癌中也具有一定效果[4]。雙硫侖的抗腫瘤活性與銅離子(Cu2+)密切相關(guān),銅離子能明顯提高雙硫侖的抗腫瘤活性[5]。但雙硫侖和雙硫侖的銅絡(luò)合物(CuET)在體內(nèi)條件下均不穩(wěn)定,生物利用度低,腫瘤靶向輸送能力差。介孔硅具有穩(wěn)定的骨架結(jié)構(gòu)、無(wú)生理毒性、較大的比表面積和孔容量、緩釋藥物和易于修飾等優(yōu)點(diǎn)[6]。而銅摻雜的介孔二氧化硅不僅能為雙硫侖提供銅離子,也能加速介孔硅的降解,減少對(duì)人體的損害[7]?；贒SF的抗腫瘤活性和介孔二氧化硅納米粒子(MSNs)的易于修飾且低毒的特性,本實(shí)驗(yàn)探討了Cu-MSNs載雙硫侖的抗腸癌作用。

1 材料與儀器

1.1 材料 硅酸四乙酯和卡培他濱(麥克林);無(wú)水乙醇(富宇試劑);三乙醇氨和5-氟尿嘧啶(阿拉丁);雙硫侖(上海源葉生物科技公司);RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素和胰酶(HyClone);非必需氨基酸(博奧拓達(dá));氨水(25%,天力);DMSO(碧云天生物);胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司);結(jié)腸癌CT26.WT細(xì)胞(北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞中心)。

1.2 儀器 DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);手提式壓力蒸汽滅菌器XYR2015-N576(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司);超聲波清洗機(jī)(潔盟);Scientz-10N冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);78HW-1數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)有限公司);FA1204B分析天平和QP-80型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(濟(jì)南好寶來(lái)醫(yī)療器材有限公司);ST40R型離心機(jī)(上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司);CX43生物顯微鏡(南京瞭望光電技術(shù)有限公司);SW-CJ-3F型生物工作臺(tái)(上海滬凈醫(yī)療器械有限公司);掃描電鏡Quanta-200 (荷蘭FEI公司);高效液相色譜儀2489(Waters 公司) 。

2 方法

2.1 二氧化硅微球的制備 采用Stober法制備二氧化硅微球[8],將10 mL的去離子水加入到50 mL的乙醇中,然后加入2.5 mL的氨水在55 ℃下水浴攪拌(1 000 r·min-1)3.5 h,期間緩慢滴加1.5 mL的硅酸四乙酯,將生成的白色產(chǎn)物離心收集(12 000 r·min-1),再用去離子水和乙醇分別洗3次白色產(chǎn)物。

2.2 二氧化硅空心微球的制備和銅摻雜 將二氧化硅微球(70 mg)和三水硝酸銅以1∶2.6的質(zhì)量混合加入到50 mL的去離子水中,期間滴加6 mL的氨水,在室溫下攪拌30 min,然后將所得的溶液加入到100 mL的反應(yīng)釜中,在140 ℃下反應(yīng)10 h,之后將所得產(chǎn)物分別用水和乙醇洗3次,得到的藍(lán)色產(chǎn)物(Cu-MSNs)[9]。

2.3 雙硫侖的載藥 將適量雙硫侖溶解于20 mL乙醇中,加入50 mg載體。超聲1 h后劇烈攪拌過(guò)夜。離心收集上清液和沉淀,得到的DSF-Cu-MSNs(DSF-NPs)沉淀凍干后備用。

2.4 CuET檢測(cè) 將5 mg的DSF-NPs加入到適量氯仿中,超聲1 h后離心收集上清液,得到具有溶出介質(zhì)的上清液。之后用紫外光譜儀全波長(zhǎng)掃描,得到溶出介質(zhì)的紫外圖譜。

2.5 形貌觀(guān)察 本實(shí)驗(yàn)采用SEM掃描電鏡觀(guān)察MSNs和Cu-MSNs的形貌以及粒徑大小。

2.6 制備工藝的優(yōu)化 粒徑是一個(gè)評(píng)價(jià)納米粒質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn),合適粒徑的納米粒會(huì)對(duì)藥物的釋放和生物利用度等因素起到重要作用[8,10]。本實(shí)驗(yàn)將采用單因素法控制變量,對(duì)二氧化硅微球的制備進(jìn)行優(yōu)化。主要優(yōu)化的有氨水和水的量和反應(yīng)溫度,每個(gè)條件設(shè)置5個(gè)梯度3組平行。

2.7 載藥量、包封率和體外釋放的測(cè)定

2.7.1 DSF標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 本實(shí)驗(yàn)采用色譜法對(duì)雙硫侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行測(cè)定。

2.7.2 色譜條件 依利特C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇-水(80∶20),流速為1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL[11]。

2.7.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取10 mg DSF標(biāo)準(zhǔn)品加入到10 mL容量瓶中,加入甲醇配制成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,梯度稀釋至100、120、140、160、180和200 μg·mL-1。測(cè)定吸收峰面積后得到DSF的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.7.4 載藥量的測(cè)定 取上清液(見(jiàn)“2.7.3”項(xiàng)下)逐級(jí)稀釋測(cè)定其吸光度,計(jì)算其濃度后利用差減法得到載藥量[12]。公式如下:

(1)

2.7.5 體外釋放 將2 mg的DSF-NPs加入到透析袋(3 500 Mw)中,透析袋置入50 mL PBS緩沖液中(0.01 mol·L-1,pH=7.4,2%SDS),之后放入旋轉(zhuǎn)搖床中孵育(37 ℃,100 r·min-1),按照設(shè)定的時(shí)間(0.5、1、2、4、6、12,24、48、72 h)每次取出5 mL溶液測(cè)定濃度計(jì)算累計(jì)釋放量,并添加5 mL PBS緩沖液[13]。

(2)

(3)

(4)

其中,Ci為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所取透析液中的DSF濃度;Ci′是相鄰兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)所取透析液DSF濃度增加的量;V為燒杯中透析液總體積;Vi為每次取透析液體積;M為加載在納米粒中DSF的質(zhì)量;Q為DSF的累計(jì)釋放量。

2.8 體外實(shí)驗(yàn)

2.8.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的CT26.WT細(xì)胞解凍、離心(1 800 r·min-1,7 min)后撇去上清,將細(xì)胞用含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(5 mL)輕輕吹散后移入培養(yǎng)瓶中。CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶后用胰蛋白酶消化,用培養(yǎng)液輕輕吹打、吹散細(xì)胞。以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)、傳代和凍存。

2.8.2 MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)取用對(duì)數(shù)周期的CT26.WT細(xì)胞進(jìn)行消化,重懸沉淀后稀釋至細(xì)胞計(jì)數(shù)2.5×104個(gè)/mL。以每孔200 μL加入到96孔板中(邊緣孔加入PBS緩沖液以防止邊緣效應(yīng))。在CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后,將DSF、DSF-Cu-MSNs、5-FU以配置好的濃度加入到96孔板中(設(shè)置3～5個(gè)復(fù)孔),培養(yǎng)48 h、72 h后加入20 μL的MTT溶液(5 μg·mL-1,PBS溶解),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心棄置上清液并加入150 μL的DMSO溶液,在水平振蕩器上振蕩5～10 min后在490 nm處測(cè)定吸光度[14-15]。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率:

(5)

3 結(jié)果

3.1 二氧化硅微球的工藝優(yōu)化 如圖1所示氨水和水對(duì)二氧化硅微球影響不成梯度變化;但隨著溫度的逐漸增大,粒徑也隨之減小。在梯度范圍內(nèi)最佳氨水、水和溫度為:1.5 mL、12.5 mL和85 ℃。

A.氨水;B.水;C.溫度圖1 不同因素對(duì)二氧化硅微球粒徑的影響

3.2 二氧化硅的銅摻雜 DSF-NPs在結(jié)合能943、968 eV具有吸收峰(見(jiàn)圖2),符合Cu2p3/2在結(jié)合能934.6 eV處有吸收峰且與其他物質(zhì)結(jié)合后吸收峰會(huì)分裂[16]。

圖2 銅摻雜介孔硅的XPS能譜

3.3 MSNs和Cu-MSNs的形貌觀(guān)察 采用SEM對(duì)MSNs和Cu-MSNs的形貌進(jìn)行觀(guān)察,由圖3可以看出MSNs和Cu-MSNs呈現(xiàn)規(guī)則的圓球形,且粒徑處于120～160 nm之間。

A、C.MSNs;B、D.Cu-MSNs A、B.×50 000;C、D.×200 000圖3 MSNs和Cu-MSNs的掃描電鏡圖像

3.4 載藥量的測(cè)定

3.4.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 DSF標(biāo)準(zhǔn)品溶液在梯度范圍內(nèi)與峰面積成良好的線(xiàn)性關(guān)系(Y=15.123X-76.142,R2=0.999 1)。

3.4.2 載藥量 將供試品溶液(n=3)逐級(jí)稀釋測(cè)量峰面積,直至測(cè)出合適的峰面積,代入DSF標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y=15.123X-76.142中可得上清液中的DSF含量,利用差減法可求得Cu-MSNs中DSF的含量,再利用公式(1)可求得載藥量為9.51%±1.04%。

3.5 藥物的體外釋放 由圖4得知,Cu-MSNs包載DSF在48 h內(nèi)釋放量?jī)H為15.5%±1.2%,而72 h時(shí)為31.2%±1.8%。說(shuō)明Cu-MSNs包載DSF具有良好的緩控釋效果,DSF能與骨架中的Cu絡(luò)合形成CuET,增加穩(wěn)定性減緩DSF的釋放。而隨著載體骨架的降解釋放的Cu2+能與DSF形成CuET,而CuET是主要的殺滅腫瘤細(xì)胞的活性物質(zhì)[17],所以用Cu-MSNs包載DSF能更好的增強(qiáng)抗腫瘤效果。

圖4 DSF的體外釋放曲線(xiàn)

3.6 CuET的檢測(cè) 對(duì)DSF-NPs溶液超聲、離心后的上清液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描后得到圖5。有研究證明雙硫侖的吸收峰在234 nm處有吸收峰,435 nm處沒(méi)有吸收峰,而CuET在435 nm處有吸收峰[17]。由圖5可知含溶出介質(zhì)上清液在435 nm處有較強(qiáng)吸收峰,證明生成了CuET。

3.7 體外抗腫瘤活性 本實(shí)驗(yàn)采用MTT毒性實(shí)驗(yàn)探究不同濃度5-Fu、DSF和DSF-NPs在48 h和72 h對(duì)CT.26WT細(xì)胞的抑制作用。隨著藥物濃度和時(shí)間的增大,對(duì)CT.26WT細(xì)胞的抑制作用也越強(qiáng),呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間的相關(guān)性。在48 h和72 h下,相較于DSF和5-Fu組,DSF-NPs的IC50值更小,進(jìn)一步證明了DSF與Cu2+絡(luò)合后具有更強(qiáng)的抗CT.26WT細(xì)胞活性。藥物組與空白組相比具有顯著性差異(n=3,**為P<0.01),結(jié)果如表1和圖6所示。

圖5 DSF-NPs溶出介質(zhì)的紫外光譜

表1 藥物的細(xì)胞毒性

A.5-Fu;B.DSF;C.DSF-NPs圖6 在48和72 h下5-Fu、DSF和DSF-NPs的體外抗腫瘤活性

4 討論

本文通過(guò)單因素法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件發(fā)現(xiàn),在一定比例的水和氨水情況下,實(shí)驗(yàn)中所制備的二氧化硅微球粒徑存在最小值,并且隨著溫度的增大而減小。將DSF包載于低粒徑的Cu-MSNs中,能有效地改良DSF不溶于水的特性,使其能較好地分散于水溶液中,為未來(lái)應(yīng)用于臨床提供了可能性,但是低粒徑的Cu-MSNs的載藥量在未來(lái)應(yīng)用中仍有較大的發(fā)展空間;通過(guò)MTT法比較各濃度的給藥組之間對(duì)CT26.WT細(xì)胞的抑制作用,發(fā)現(xiàn)DSF-NPs的IC50值最小,說(shuō)明DSF與銅離子結(jié)合后有效地提升了抗腸癌細(xì)胞的效果,銅摻雜介孔硅能為DSF提供銅離子的同時(shí)也能加速M(fèi)SNs的降解,因此DSF-NPs在抗腸癌中具有優(yōu)良的潛力。近年來(lái),關(guān)于生物安全性高的介孔硅改造的研究越來(lái)越多,未來(lái)DSF-NPs在抗腸癌臨床應(yīng)用中具有潛力。