張義堂 秦小菀 石 巖 侯海燕 殷 雪 李 哲 徐會民 劉麥葉 李萬楨 宋春雨

南陽市中心醫(yī)院，河南 南陽 473000

熱性驚厥在呼吸道感染嬰幼兒中較為常見，尤其是6個月至5歲的患兒，發(fā)病率為2%～5%。由于嬰幼兒體溫調節(jié)中樞發(fā)育不完善，易高熱發(fā)生驚厥，導致神經系統功能紊亂［1-2］。熱性驚厥頻繁發(fā)作可能遺留神經系統后遺癥，最常見的表現為癲癇發(fā)作［3-4］。近年來，分子標志物與熱性驚厥的研究較為熱門，微小RNA（microRNA，miR）是一種小分子的內源性非編碼RNA，在血液中非常穩(wěn)定，不容易降解，這種特性使得miR 十分適合作為疾病的診斷標志物。有研究發(fā)現血清miR-148a-3p 高水平與熱性驚厥密切相關［5］，但尚未有研究分析miR-148a-3p 對熱性驚厥繼發(fā)癲癇的預測價值［6-7］。高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一種神經體質炎癥介質，目前研究發(fā)現炎癥反應在熱性驚厥及癲癇發(fā)作中具有重要作用，HMGB1表達過量增加兒童癲癇發(fā)病風險［8-9］，不過HMGB1對于熱性驚厥繼發(fā)的癲癇是否也產生影響尚未可知。研究證實維生素D缺乏與兒童癲癇密切相關［10］，維生素D具有神經穩(wěn)定作用，但熱性驚厥患兒繼發(fā)癲癇是否與維生素D 缺乏有關，國內鮮有報道，血清25-羥維生素D（25 hydroxyvitamin D，25（OH）D）能否作為熱性驚厥繼發(fā)癲癇的標志物值得分析。本研究探討熱性驚厥患兒血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 水平與預后癲癇發(fā)作的相關性，分析各項指標對熱性驚厥繼發(fā)癲癇的預測價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象回顧性分析2018-01—2022-03 南陽市中心醫(yī)院收治的122 例熱性驚厥患兒。納入標準：（1）符合熱性驚厥的診斷標準［11］，肛溫≥38 ℃伴隨驚厥發(fā)作；（2）首次確診的熱性驚厥；（3）年齡≤5周歲；（4）病歷資料齊全。排除標準：（1）既往有癲癇病史；（2）合并先天性、遺傳性疾?。唬?）腦外傷、腦出血、腦發(fā)育畸形、缺血缺氧性腦病、顱內感染等；（4）心血管疾病、肝腎疾病、血液病、營養(yǎng)不良、代謝性疾病、惡性腫瘤等。根據熱性驚厥患兒預后結局是否發(fā)生癲癇，分為熱性驚厥癲癇組36 例和熱性驚厥非癲癇組86 例。小兒癲癇的診斷標準［12］：有明確的癲癇發(fā)作癥狀，腦電圖異常放電為診斷金標準，結合磁共振檢查可確診。同期選擇55例未發(fā)生驚厥的呼吸道感染僅發(fā)熱的患兒為對照組。對照組患兒符合急性上呼吸道感染的診斷標準，肛溫≥38 ℃，未發(fā)生驚厥，年齡≤5周歲，排除其他任何疾病。3組患兒一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 3組患兒一般資料比較Table 1 Comparison of general data among three groups of children

1.2 檢測方法所有患兒入院時采集外周靜脈血，3 500 r/min離心分離血清。

1.2.1 血清miR-148a-3p 檢測：geneMAG-RNA/DNA試劑盒（美國Chemicell 公司）。將樣本與RNA 抽提劑以體積1∶1.5 的比例混合，再加入氯仿混合均勻，4 ℃下離心得到上層清液。將上層清液轉移至另一離心管中，得到捕獲有miR-148a-3p 的磁珠。加入5 mol/L硫氰酸胝緩沖液混合均勻，加入不含RNA酶的無核酸酶洗脫液，60～70 ℃水浴，從磁珠上洗脫捕獲的miR-148a-3p。室溫條件下離心，得到含有miR-148a-3p的樣本，置于—80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應，試劑盒購自美國ABI 公司。反應體系：100 mmol/L dNTPs 0.15 μL、Multiscribe反轉錄酶1 μL，10×反轉錄緩沖液1.5 μL，RNA 抑制劑0.19 μL，反轉錄引物2 μL，含微小RNA的提取樣品2 μL，無核酸酶的水8.2 μL，反應體系15 μL/管。反應程序：16 ℃30 min，42 ℃30 min，85 ℃5min，4 ℃保存。miR-148a-3p熒光定量聚合酶鏈式反應，TaqMan 2*Universal PCR Master Mix 10 μL，Nuclease-free water 7 μL，Primer probe l μL，反轉錄產物2 μL，反應體系20 μL/管，2 次重復。反應程序：50 ℃2 min，95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃60 s循環(huán)40 次。參照說明書采用2-ΔΔCt法計算miR-148a-3p 的相對表達量。

1.2.2 血清HMGB1 檢測：采用酶聯免疫吸附法檢測，試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。檢測儀器為800TS 酶標儀（美國BioTek 公司），嚴格按照試劑盒說明操作。

1.2.3 血清25（OH）D檢測：采用化學發(fā)光法檢測，試劑盒購自上海紀寧生物有限公司，檢測儀器為180SE全自動化學發(fā)光儀（拜耳公司），嚴格按照試劑盒說明操作。

1.3 資料收集方法查閱患兒病歷，收集下列資料：性別、月齡、肛溫、身高、體質量、驚厥類型、高熱持續(xù)時間、驚厥持續(xù)時間、癲癇家族史、是否早產、是否低出生體質量、是否有圍生期窒息史、退熱后腦電圖結果。

1.4 統計學方法使用SPSS 22.0統計分析軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，3組比較采用方差分析。計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗。多因素分析采用Logistic 回歸分析。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算ROC曲線下面積（area under curve，AUC）、靈敏度、特異度以及最佳截斷值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患兒血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 水平比較熱性驚厥癲癇組的血清miR-148a-3p表達量高于熱性驚厥非癲癇組、對照組（P＜0.05），并且熱性驚厥非癲癇組的血清miR-148a-3p 表達量高于對照組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組的血清HMGB1 水平高于熱性驚厥非癲癇組、對照組（P＜0.05），且熱性驚厥非癲癇組的血清HMGB1水平高于對照組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組的血清25（OH）D水平低于熱性驚厥非癲癇組、對照組（P＜0.05），且熱性驚厥非癲癇組的血清25（OH）D水平低于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 3組患兒血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D水平比較 （±s）Table 2 Comparison of serum miR-148a-3p, HMGB1, and 25（OH）D levels among three groups of children （±s）

表2 3組患兒血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D水平比較 （±s）Table 2 Comparison of serum miR-148a-3p, HMGB1, and 25（OH）D levels among three groups of children （±s）

注：miR-148a-3p為微小RNA-148a-3p；HMGB1為高遷移率族蛋白B1；25（OH）D為25-羥維生素D；與對照組比較，①P＜0.05；與熱性驚厥非癲癇組比較，②P＜0.05

組別熱性驚厥癲癇組熱性驚厥非癲癇組對照組F值P值n 36 86 55 miR-148a-3p 2.26±0.57①②1.71±0.43①1.50±0.38 32.248＜0.001 HMGB1（μg/L）7.45±1.87①②6.70±1.58①5.33±1.29 22.603＜0.001 25（OH）D（μg/L）26.83±6.79①②34.24±8.56①42.16±4.15 52.224＜0.001

2.2 熱性驚厥導致癲癇發(fā)作的單因素分析熱性驚厥癲癇組與熱性驚厥非癲癇組驚厥類型、高熱持續(xù)時間、驚厥持續(xù)時間、癲癇家族史、退熱后腦電圖結果比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒復雜性熱性驚厥的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒高熱持續(xù)時間≥24 h 的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒驚厥持續(xù)時間≥15 min的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒有癲癇家族史的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。熱性驚厥癲癇組患兒腦電圖異常的比例高于熱性驚厥非癲癇組（P＜0.05）。2組患兒早產兒、低出生體質量兒、圍生期窒息史比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 熱性驚厥導致癲癇發(fā)作的單因素分析 ［n（%）］Table 3 Single factor analysis of epilepsy caused by febrile convulsion ［n（%）］

2.3 熱性驚厥導致癲癇發(fā)作的多因素logistic 回歸分析以癲癇發(fā)作為因變量，以單因素分析中有統計學意義的因素：驚厥類型、高熱持續(xù)時間、驚厥持續(xù)時間、癲癇家族史、退熱后腦電圖結果、miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 為自變量，進行Logistic回歸分析。賦值：癲癇發(fā)作：是=1，否=0；驚厥類型：復雜性=1，單純性=0；高熱持續(xù)時間≥24 h=1，＜24 h=0；驚厥持續(xù)時間≥15min=1，＜15min=0；癲癇家族史：是=1，否=0；退熱后腦電圖結果：異常=1，正常=0。結果顯示，驚厥類型、驚厥持續(xù)時間、退熱后腦電圖結果、miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D與癲癇發(fā)作存在相關關系（P＜0.05），見表4。

表4 熱性驚厥導致癲癇發(fā)作的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of epilepsy caused by febrile convulsion

2.4 血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 預測熱性驚厥患兒癲癇發(fā)作的ROC 曲線分析ROC 曲線顯示，血清miR-148a-3p 截斷值為1.93（AUC=0.850，95% CI：0.777～0.924），血清HMGB1 截斷值為7.00 μg/L（AUC=0.802，95% CI：0.720～0.884），血清25（OH）D 截斷值為30.85 μg/L（AUC=0.703，95%CI：0.599～0.808），對熱性驚厥患兒癲癇發(fā)作的預測效能最高，靈敏度和特異度分別見表5。ROC曲線見圖1。

圖1 miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 預測熱性驚厥患兒癲癇發(fā)作的ROC曲線Figure 1 ROC curves of miR-148a-3p，HMGB1，25（OH）D predicting epilepsy in children with febrile convulsion

表5 血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D預測熱性驚厥患兒癲癇發(fā)作的ROC曲線分析Table 5 Analysis of ROC curves of serum miR-148a-3p，HMGB1，25（OH）D predicting epilepsy in children with febrile convulsion

3 討論

熱性驚厥是嬰幼兒常見疾病，絕大部分患兒預后良好，但仍有少部分患兒最終進展為癲癇［13］。文獻報道［14］，既往有過熱性驚厥病史的嬰幼兒日后發(fā)生癲癇的患病率遠高于無熱性驚厥病史的嬰幼兒。熱性驚厥導致癲癇發(fā)作的發(fā)病機制尚不明確，可能與遺傳、年齡、發(fā)熱程度、免疫、感染等多因素有關［15-16］。熱性驚厥好發(fā)于6 個月至5 歲，高峰期為1～2 歲，6 歲以上較少發(fā)作，這種年齡相關性可能與嬰幼兒大腦發(fā)育不完善有關［13，17］，嬰幼兒大腦皮質分化不全、神經元的樹突、軸突形成不足，尚未形成大腦各區(qū)復雜的交織，出生后2歲神經膠質細胞才完全形成，神經纖維分支加長，至6 歲左右大腦半球的神經傳導通路完全髓鞘化。高熱會增加大腦需氧量，降低神經元興奮閾值，刺激神經元異常放電，繼而形成驚厥。高熱驚厥損傷了大腦皮質神經細胞，為日后癲癇發(fā)作埋下隱患［18-19］。本研究單因素分析發(fā)現，驚厥類型、高熱持續(xù)時間、驚厥持續(xù)時間、癲癇家族史、退熱后腦電圖結果有關，且多因素Logistic 回歸分析顯示復雜性熱性驚厥、驚厥持續(xù)時間≥15 min、退熱后腦電圖結果異常是導致癲癇發(fā)作的高危因素。分析原因：復雜性熱性驚厥的患兒在體溫非高熱的時候也會發(fā)生驚厥，驚厥時間長，24 h內發(fā)作次數多，預后較單純性高熱驚厥差，進展為癲癇的風險較高［20］。多項研究表示，有癲癇家族史、腦電圖異常、復雜性熱性驚厥是熱性驚厥患兒繼發(fā)癲癇的影響因素［21-22］。

本研究顯示，熱性驚厥癲癇組的血清miR-148a-3p表達量高于熱性驚厥非癲癇組，且驚厥非癲癇組的血清miR-148a-3p表達量也高于對照組，提示miR-148a-3p 表達與熱性驚厥以及癲癇發(fā)作有關。有體外實驗分析miR-148a-3p 表達與癲癇發(fā)作的機制，結果顯示丙戊酸鈉通過激活miR-148a-3p/Mcl-1通路促進人神經母細胞瘤細胞凋亡，揭示miR-148a-3p高表達與癲癇發(fā)作有關［23］。miR-148a-3p是由內源基因編碼的單鏈RNA 分子，通過與靶信使mRNA 特異性結合，調節(jié)其他基因的表達。miR-148a-3p轉錄獨立于其他基因，并不翻譯成蛋白質，miR-148a-3p作為天然存在的基因表達的調控分子，導致癲癇的機制可能與神經毒性有關［25］。本研究發(fā)現miR-148a-3p 預測熱性驚厥患兒繼發(fā)癲癇的靈敏度為83.33% ，特異度為74.42% ，提示miR-148a-3p 可以對熱性驚厥患兒是否癲癇發(fā)作的預后進行預測，miR-148a-3p能夠作為評價熱性驚厥疾病轉歸的預測指標。

HMGB1是重要的炎癥介質，在感染所致的高熱患兒中血清HMGB1處于較高水平，并且熱性驚厥患兒的血清HMGB1 水平高于僅高熱患兒。本研究顯示，熱性驚厥癲癇組的血清HMGB1水平高于熱性驚厥非癲癇組，并且驚厥非癲癇組的血清HMGB1水平也高于對照組，提示HMGB1水平與熱性驚厥引起的癲癇發(fā)作有關。HMGB1 在高熱驚厥患兒的作用機制：熱性驚厥患兒機體發(fā)生感染時，巨噬細胞活化，主動分泌HMGB1釋放至細胞外，同時分泌多種炎癥因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，激活環(huán)氧化酶途徑導致發(fā)熱，炎癥因子又會作用于單核細胞、內皮細胞，擴大炎癥反應。HMGB1 與癲癇發(fā)作的機制尚未完全明朗，可能與Toll樣受體機制有關，確切的分子機制有待深入分析。本研究發(fā)現HMGB1 預測熱性驚厥繼發(fā)癲癇的靈敏度為77.78%，特異度為68.60%，提示HMGB1具有一定的預測價值，可以作為熱性驚厥繼發(fā)癲癇的標志物。

本研究發(fā)現，25（OH）D 水平可能與熱性驚厥繼發(fā)癲癇有關，繼發(fā)癲癇的患兒血清25(OH)D 水平處于較低水平，低于無癲癇的熱性驚厥患兒，也明顯低于發(fā)熱但無驚厥的對照組患兒。目前已有研究證實維生素和微量元素缺乏易誘發(fā)癲癇，25（OH）D 是維生素D在體內的主要存在形式，不僅影響鈣磷代謝，而且與神經系統發(fā)育密切相關。25（OH）D具有營養(yǎng)神經作用，通過合成神經遞質，增強神經系統功能，促進嬰幼兒大腦發(fā)育。維生素D缺乏可使熱性驚厥嬰幼兒的神經元興奮性升高，膜電位異常，誘發(fā)癲癇。本研究顯示，血清25（OH）D 水平預測高熱驚厥患兒癲癇發(fā)作的靈敏度為72.22%，特異度為63.95%，具有一定的預測價值。鑒于維生素D 缺乏與癲癇發(fā)作存在關聯，臨床推薦熱性驚厥嬰幼兒可適當補充維生素D 改善營養(yǎng)狀態(tài)，降低癲癇發(fā)作風險。

血清miR-148a-3p、HMGB1、25（OH）D 水平與熱性驚厥患兒癲癇發(fā)作有一定相關性，可作為臨床輔助診斷標志物。鑒于臨床條件限制，本研究樣本量較少，預測價值統計分析尚存在一定偏倚，今后還需擴大樣本量聯合多中心調查。另外，相關指標的分子機制也尚不明確，還有待體外實驗證實。