李燕平,覃川杰,呂云云,龔 全,王 均,頡 江,文正勇
(1.內(nèi)江師范學(xué)院,長(zhǎng)江上游魚類資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川內(nèi)江 641112;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所,成都 611730)
黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)隸屬于鯰形目(Siluriformes)鲿科(Bagridae),廣泛分布于長(zhǎng)江、黃河、珠江、沅江及黑龍江等各水域[1,2],是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚類和主要養(yǎng)殖對(duì)象[3]。然而,因人工繁育隨意留種可能出現(xiàn)的近親繁殖、廣泛交易、增殖放流、自然逃逸等原因有可能使種群的遺傳多樣性水平降低。庫喜英等[4]以線粒體DNA為標(biāo)記,對(duì)采自長(zhǎng)江、珠江、遼河、閩江、富春江和韓江6個(gè)水系的21個(gè)采樣點(diǎn)的黃顙魚進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明黃顙魚的群體遺傳多樣性為中度多態(tài),群體間遺傳分化極小,已缺乏明顯的地理結(jié)構(gòu)。
微衛(wèi)星DNA即短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat,SSR),廣泛存在于真核生物基因組中。與傳統(tǒng)分子標(biāo)記相比,它具有突變速率快、呈共顯性、穩(wěn)定性好、易檢測(cè)等優(yōu)勢(shì),已被廣泛應(yīng)用于水生生物遺傳多樣性評(píng)估、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、物種分類、親緣關(guān)系分析、標(biāo)記輔助育種以及遺傳圖譜構(gòu)建等[5-8]。李大宇等[9]利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)6個(gè)群體(吉林省大安市月亮湖野生黃顙魚、四川野生黃顙魚、黑龍江省哈爾濱市松花江段黃顙魚、湖北省荊州市長(zhǎng)湖野生黃顙魚親本以及子代和天津市換新國(guó)家級(jí)原良種場(chǎng)黃顙魚1號(hào))的黃顙魚遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行解析。胡玉婷等[10]采用微衛(wèi)星標(biāo)記分析了長(zhǎng)江、淮河兩水系安徽區(qū)段黃顙魚群體的遺傳多樣性。
目前,黃顙魚遺傳多樣性及群體親緣關(guān)系的研究主要集中在自然地理群體。隨著長(zhǎng)江十年禁漁計(jì)劃的實(shí)施,天然水域親本采集的難度變大。因此,了解和掌握人工養(yǎng)殖群體的黃顙魚種群結(jié)構(gòu)、群體遺傳多樣性,有助于為黃顙魚良種選育、苗種繁育等提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)基于8對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估,以期為黃顙魚家系建立,提高黃顙魚遺傳育種潛力、縮短育種年限和加快新品種的選育提供數(shù)據(jù)支撐。
本實(shí)驗(yàn)所用黃顙魚取自四川省14個(gè)養(yǎng)殖群體,通過咨詢其親本來源,確定其親本群體來自于江蘇溧陽(HJ)、四川邛崍(HQ)、廣東佛山(LG)、安徽安慶(YB)、湖北仙桃(YH)、浙江德清(YZ)、湖南岳陽(DB)、湖北荊門(WH)、四川宜賓(XB)、湖北咸寧(XH)、江蘇鹽城(ZJ)、四川樂山(ZL)、浙江湖州(LZ)和廣西南寧(RB),每個(gè)親本群體的詳細(xì)信息見表1。其中,除HJ,YH和XH分別采集到17,13和14尾樣本外,其余11個(gè)群體每個(gè)群體的樣本數(shù)均為15尾,共采集209尾樣本。取部分尾鰭組織保存于95%乙醇中,置于-20℃冷藏備用。
表1 14個(gè)養(yǎng)殖黃顙魚群體的采樣信息Tab.1 Sampling information of 14 cultured populations of P.fulvidraco
1.2.1 基因組DNA提取和質(zhì)量檢測(cè)
對(duì)所有樣本采用酚氯仿抽提法獲得基因組DNA,具體DNA提取步驟參考文獻(xiàn)[11]。對(duì)提取出的DNA,首先用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量,并使用Nanodrop 2000(賽默飛,美國(guó))進(jìn)一步檢測(cè)DNA的濃度和純度,滿足PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 多態(tài)性微衛(wèi)星篩選、擴(kuò)增和分型檢測(cè)
本研究參考文獻(xiàn)[9]隨機(jī)挑選11對(duì)引物用于本研究的黃顙魚養(yǎng)殖群體的多態(tài)性初篩。隨機(jī)挑選的11對(duì)引物的具體信息見表2。經(jīng)過在14個(gè)群體,每個(gè)群體挑選8個(gè)個(gè)體進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示有3對(duì)引物(SS37,SS81和SS89)在本研究的樣本中擴(kuò)增失敗或呈單態(tài),最終確定8對(duì)引物用于本研究,并在這8對(duì)引物的正向5′端加上FAM熒光標(biāo)記,方便后續(xù)進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型。本實(shí)驗(yàn)所用的引物及熒光染料由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。
表2 用于本研究14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體的引物序列情況Tab.2 Microsatellite marker sequences used in 14 cultured populations of P.fulvidraco
PCR擴(kuò)增體系為:20 μL反應(yīng)體系包含2 μL 10×Pfu Buffer(含有Mg2+),10 μmol/L正反向引物各0.8 μL,0.8 μL dNTP(10 μmol/L),1.5 μL基因組DNA(20 ng/μL)和0.4 μL Taq酶,最終用去離子水補(bǔ)到20 μL。采用降落PCR擴(kuò)增,具體反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s、61 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共10個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.2 ℃);95變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共32個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.1 ℃);72 ℃延伸5 min;10 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè),在6.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行。非變性聚丙烯酰胺凝膠制作的標(biāo)準(zhǔn)步驟參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行[12]。將1.5 μL PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合后依次加樣于凝膠的加樣孔內(nèi),于220 V恒定電壓下電泳1.5~2.5 h。電泳結(jié)束后,用EB染色,并在紫外凝膠成像系統(tǒng)中掃描、保存。通過pBR322 DNA/MspI分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比初步確定等位基因大小。將檢測(cè)到目的條帶的產(chǎn)物上樣于ABI3730xl分析儀(蘇州金唯智生物科技有限公司)進(jìn)行毛細(xì)管電泳,檢測(cè)產(chǎn)物片段大小。
根據(jù)14個(gè)群體在8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因分型數(shù)據(jù),首先使用CONVERT 1.3將其轉(zhuǎn)化為STRUCTURE,POPGENE以及ARLEQUIN等軟件能夠識(shí)別的格式[13],再利用POPGENE 1.3.1[14]計(jì)算14個(gè)群體各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Hardy-Weinberg平衡遺傳偏離指數(shù)和Nei′s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離等參數(shù);利用CERVUS 3.0.3計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)[15];使用ARLEQUIN 3.5計(jì)算兩兩群體之間的遺傳分化指數(shù)(Fst)并進(jìn)行分子方差分析(analasis of molecular variation,AMOVA)[16];使用MEGA 7軟件基于Nei′s遺傳距離構(gòu)建UPGMA聚類樹[17];最后利用STRUCTURE 2.3.4中的貝葉斯聚類[18],基于混合模型找到聚類值(K值),MCMC鏈長(zhǎng)設(shè)置為20 000,每次運(yùn)行舍棄的樣本數(shù)設(shè)置為2 000,遺傳分組K值設(shè)置為1~14,每次分析重復(fù)運(yùn)行10次,將運(yùn)行的結(jié)果提交到Structure Harvester確定最佳的K值[19],再用CLUMPP 1.1.2軟件進(jìn)行重復(fù)聚類分析[20],最后利用DISTRUCT 1.1軟件將CLUMPP的結(jié)果進(jìn)行可視化[21]。
8個(gè)位點(diǎn)在14個(gè)群體中的等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù),以及各個(gè)群體的平均值見表3。14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體中,平均觀測(cè)雜合度在0.633~0.717之間,其中HQ和WH群體最低,最高的為XB和LZ群體;平均期望雜合度在0.358~0.749之間,最低群體為RB,最高群體為L(zhǎng)G;平均多態(tài)信息含量在0.893~0.681之間,多態(tài)信息含量最低的為WH群體,最高的為YB群體,14個(gè)群體的平均多態(tài)信息含量均大于0.5,說明14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性均處于高度多態(tài)的水平;平均有效等位基因數(shù)在5.160~6.882之間,RB群體最低,DB群體最高(表3)。
表3 14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性信息Tab.3 Information on genetic diversity in four-teen populations of P.fulvidraco
續(xù)表3
對(duì)14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體的分子方差分析(AMOVA)結(jié)果顯示,3.69%的遺傳變異來自群體間,3.93%來自群體內(nèi)個(gè)體間,92.38%來自所有個(gè)體間,表明群體間的遺傳變異主要來自所有個(gè)體間(表4)。
表4 基于8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的分子方差分析結(jié)果Tab.4 Result of AMOVA based on 8 microsatellite loci
14個(gè)黃顙魚群體的遺傳分化指數(shù)在-0.009~0.116之間,其中RB群體和WH群體的遺傳分化最大(Fst=0.116),ZL群體和XB群體的遺傳分化最小(Fst=-0.009)。根據(jù)WRIGHT[22]對(duì)遺傳分化指數(shù)(Fst)的劃分標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)Fst<0.05時(shí),表明群體間遺傳分化較小;當(dāng)0.05
表5 14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳分化指數(shù)(Fst)Tab.5 Pair-wise Fst values calculated from eight microsatellite loci among 14 populations of P.fulvidraco
8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis)和總近交系數(shù)(Fit)分別為0.007 1和0.072 0(表6),說明黃顙魚群體內(nèi)存在一定程度的近交現(xiàn)象。各基因座的基因交流均值為3.573。
表6 黃顙魚養(yǎng)殖群體8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的F-統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)Tab.6 F-statistics for P.fulvidraco populations at eight microsatellite loci
14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳相似度和Nei′s遺傳距離的結(jié)果表明,群體間的Nei′s遺傳距離在0.055 0~0.431 4之間變化,遺傳相似度在0.649 6~0.946 0之間(表7)。其中,HJ和DB群體的遺傳距離最遠(yuǎn),遺傳相似度最低,而XB和ZL的遺傳距離最近,遺傳相似度最高。說明HJ和DB群體的遺傳分化最大,親緣關(guān)系最遠(yuǎn),而XB和ZL群體的親緣關(guān)系最近。
表7 14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳相似性系數(shù)(右上角)和Nei′s遺傳距離(左下角)Tab.7 Matrix of pair-wise genetic similarity coefficient(above diagonal)and Nei′s genetic distance(below diagonal)among 14 populations of P.fulvidraco
基于Nei′s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類樹結(jié)果顯示,HJ、YZ、YH、YB首先聚為一個(gè)分支,HQ和LG分別聚為一個(gè)分支,三個(gè)分支聚類后再與LZ和RB聚在一起,最后與余下的DB、ZJ、WH、XH、XB和ZL聚在一起,與遺傳距離的結(jié)果一致(圖1a)。在黃顙魚Structure群體遺傳結(jié)構(gòu)分析中,Delta K隨著亞群數(shù)K的增加而變動(dòng),K=5時(shí),Delta K出現(xiàn)最大的拐點(diǎn)(圖1b),表示K=5是最可能的模型,推測(cè)本研究的14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體分為5個(gè)亞群最合適(圖1c),與UPGMA聚類樹的結(jié)果一致。
圖1 黃顙魚群體的遺傳結(jié)構(gòu)聚類分析Fig.1 Genetic clustering analysis among populations of P.fulvidraco(a)基于Nei′s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖;(b)Delta K值的變化曲線;(c)K=5時(shí)的structure聚類結(jié)果,不同顏色代表不同的簇。
物種間親緣關(guān)系越近,SSR引物的通用性越高。本研究選用11對(duì)前期通過磁珠富集法結(jié)合同位素雜交法在黃顙魚野生群體中開發(fā)出的微衛(wèi)星引物[9],檢測(cè)黃顙魚養(yǎng)殖群體中的遺傳多樣性,結(jié)果顯示8對(duì)多態(tài)性引物擴(kuò)增成功且呈多態(tài),通用率為72.73%,表現(xiàn)出較為理想的擴(kuò)增結(jié)果,說明野生黃顙魚群體中開發(fā)出的微衛(wèi)星位點(diǎn)可用于黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)的評(píng)估、保護(hù)遺傳學(xué)研究。
生物群體的遺傳多樣性是評(píng)價(jià)物種資源狀況的一個(gè)重要依據(jù)。李大宇等[9]發(fā)現(xiàn)吉林、四川、黑龍江、湖北等省天然水系野生的6個(gè)黃顙魚群體的多態(tài)性指標(biāo)均適中。王婷婷等[23]報(bào)道了湖州菱湖養(yǎng)殖場(chǎng)(取自太湖支流大海漾群體的后代)、蘇州澄湖、太湖和四川眉山養(yǎng)殖場(chǎng)的4個(gè)黃顙魚群體的遺傳多樣性及親緣關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)群體的多態(tài)性指標(biāo)處于中等水平,群體間遺傳分化不明顯,4個(gè)群體的親緣關(guān)系較近。目前有關(guān)黃顙魚遺傳多樣的研究主要集中在不同地理分布群體,有關(guān)人工養(yǎng)殖群體種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的研究較少。黃顙魚已是中國(guó)廣泛養(yǎng)殖的小型名優(yōu)經(jīng)濟(jì)類,具有繁育場(chǎng)多、交易廣泛、逃逸和放流頻繁等特點(diǎn)。因此,探討人工養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性是持續(xù)利用種質(zhì)資源的前提。
多態(tài)信息含量PIC用來描述微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳變異程度,含量的高低與變異程度成正比。根據(jù)BOTSTEIN等[24]對(duì)PIC的劃分標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)PIC<0.25,該位點(diǎn)為低度多態(tài);當(dāng)0.25
基因雜合度也是衡量群體變異的最適參數(shù)之一,代表群體中雜合子在某個(gè)位點(diǎn)上的頻率,體現(xiàn)群體的進(jìn)化程度[27]。TAKEZAKI等[28]通過微衛(wèi)星標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)期望雜合度和觀測(cè)雜合度大于0.3時(shí),表明群體具有遺傳多樣性的基礎(chǔ)。本研究14個(gè)群體的平均期望雜合度Ho在0.633~0.717之間,平均觀測(cè)雜合度He在0.358~0.749,表明14個(gè)養(yǎng)殖黃顙魚群體具有較高的遺傳多樣性,有較好的選育潛力。14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體有12個(gè)群體(HJ、HQ、LG、YB、YH、YZ、DB、WH、XB、XH、ZL和LZ)的平均觀測(cè)雜合度低于平均期望雜合度,推測(cè)可能是由于普遍存在近交情況而使得群體發(fā)生純合,進(jìn)而導(dǎo)致雜合度降低。其余2個(gè)群體(ZJ和RB)的觀測(cè)雜合度大于期望雜合度,其中,ZJ群體觀測(cè)雜合度超出期望雜合度的程度較小,說明該群體的遺傳性較為穩(wěn)定;相反,RB群體的觀測(cè)雜合度超出期望雜合度的程度較大,可能是由于該群體摻雜了野生群體或其他群體中的放流個(gè)體,這些個(gè)體與RB群體雜交導(dǎo)致遺傳平衡遭到破壞。建議在考慮RB群體繁殖選育過程中應(yīng)該盡量擴(kuò)大選育的范圍,同時(shí)也要防止養(yǎng)殖個(gè)體的放流逃逸,避免具有同樣群體遺傳背景的個(gè)體之間交配,增加人工選育的難度。
本研究14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳分化指數(shù)在-0.009~0.116之間波動(dòng),其中在兩兩群體比較的組別中,有64組的Fst小于等于0.05,其余27組的Fst均在0.05~0.15之間。當(dāng)Fst<0.05時(shí),表明群體間遺傳分化較弱;當(dāng)0.05
本研究黃顙魚養(yǎng)殖群體間的基因交流是引起其群體間遺傳分化程度低的重要因素。本研究中群體間基因流的均值(Nm)為3.573。研究表明,當(dāng)Nm大于1時(shí),基因流引起群體間遺傳分化大于來自于遺傳漂變的影響;而當(dāng)Nm小于1時(shí),遺傳漂變對(duì)群體間遺傳分化的影響要大于基因流的作用[29]。本研究中,在對(duì)14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體8對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星分析結(jié)果中,只有一對(duì)引物SS9的基因流小于1,其余7對(duì)引物的基因流均大于1,表明黃顙魚養(yǎng)殖群體間有明顯的基因流存在,導(dǎo)致各群體間未有明顯的遺傳分化。
本研究基于Nei′s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類樹與Structure分析中的結(jié)果表現(xiàn)出較強(qiáng)的一致性,通過Structure軟件對(duì)黃顙魚群體進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)檢測(cè),采用ΔK推測(cè)K=5是最可能的模型,即14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體可以分為5個(gè)亞群。此外,聚類的先后順序可以反映出種群之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。基于本研究的聚類結(jié)果可以看出,XB和ZL的遺傳相似度最高,親緣關(guān)系最近;而HJ和DB的遺傳相似度最小,親緣關(guān)系最遠(yuǎn),這個(gè)結(jié)果與遺傳距離的結(jié)果也是一致的,即XB和ZL的遺傳距離最小,而HJ和DB的遺傳距離最大。XB和ZL的親緣關(guān)系最近的原因可能是由于這兩個(gè)群體的親本都來自四川,而HJ和DB兩個(gè)群體的遺傳相似度最低,親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的原因可能是由于這兩個(gè)群體的親本來源相差大造成的,HJ群體的親本來自江蘇、而DB群體的親本來自四川。此外,盡管通過Structure分析把14個(gè)黃顙魚群體分為5個(gè)亞群,但是各亞群之間基因交流頻繁,這和14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體處于中等偏低的遺傳分化水平吻合。
綜上所述,基于微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)14個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,14個(gè)黃顙魚群體之間存在中等偏低的遺傳分化水平,且變異來源主要來自個(gè)體間。14個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性均處于高度多態(tài)的水平,遺傳多樣性豐富,可作為家系選育的基礎(chǔ)群體。在今后的育種工作中,可以利用不同群體不同個(gè)體間的遺傳距離以及聚類關(guān)系圖進(jìn)行輔助繁殖配組,指導(dǎo)家系建立和群體選育??苫谶z傳距離的結(jié)果,把親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的群體建立繁育群組,最大限度地避免近親交配,同時(shí)也保持群體的遺傳多樣性,這對(duì)提高黃顙魚遺傳育種潛力、縮短育種年限和加快新品種的選育具有重要的指導(dǎo)意義。