周惠敏，施文正，2，徐冠洪，曲映紅，2

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.青田愚公農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江麗水 323900)

池塘養(yǎng)殖具有范圍廣、密度高等特點(diǎn)，但因長期投放飼料喂養(yǎng)，會造成水體污染，從而造成淡水魚土腥味較重，影響水產(chǎn)品風(fēng)味[1]。而稻田養(yǎng)殖天然餌料豐富，具有良好的生態(tài)環(huán)境，可以實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)資源循環(huán)利用、增加糧食和魚類的產(chǎn)量、增加收入[2]。在稻田中養(yǎng)殖鯉(Cyprinuscarpio)，可少用或不用農(nóng)藥、獸藥，食用更加安全，且其肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，鱗軟可食，深受消費(fèi)者青睞。

淡水魚的風(fēng)味指自身游離氨基酸、呈味核苷酸和揮發(fā)性化合物等因素[3]。研究表明水產(chǎn)品的風(fēng)味受養(yǎng)殖模式和季節(jié)等因素影響[4]。如劉崇萬等[5]研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式和池塘循環(huán)水槽養(yǎng)殖模式的斑點(diǎn)叉尾鮰(Letauruspunetaus)肌肉營養(yǎng)品質(zhì)有顯著性差異；施文正等[6]研究發(fā)現(xiàn)野生草魚(Ctenopharyngodonidella)與養(yǎng)殖草魚的揮發(fā)性成分有顯著性差異。

為探究稻田養(yǎng)殖和池塘養(yǎng)殖鯉肌肉滋味和氣味的差異，本研究采集兩種養(yǎng)殖環(huán)境下的鯉進(jìn)行感觀分析，為鯉品質(zhì)提升及風(fēng)味優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

同一批鯉魚苗在池塘中養(yǎng)殖到7月后，一部分繼續(xù)在池塘中養(yǎng)殖(CT組)，另一部分放入稻田中養(yǎng)殖(DT組)。2021年8-10月，每月20日在池塘和稻田進(jìn)行分別采樣，采樣時(shí)個體大小基本一致，體重差≤20 g；采樣量每次6尾。7月采樣的鯉記為K7；8、9、10月稻田采集樣品記為DT8、DT9和DT10；8、9、10月池塘采集樣品記為CT8、CT9和CT10。?；钸\(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

6種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品、17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品(色譜級)，美國Sigma公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、甲醇(色譜級)，上海泰坦科技有限公司；氫氧化鈉(NaOH)、三氯乙酸(TCA)、氫氧化鉀(KOH)、高氯酸，源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H2050R型高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀有限公司；A25型實(shí)驗(yàn)室小型均質(zhì)機(jī)，上海?？嗽O(shè)備有限公司；LA-8080型全自動氨基酸分析儀，日本Hitachi公司；W26955型高效液相色譜儀，美國Waters公司；GL Intertsil ODS-3型液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，上海泰坦科技有限公司；6890 GC-5975 MS聯(lián)用儀，美國Agilent公司；固相微萃取(SPME)手動進(jìn)樣手柄，美國Supelco公司，65 μm PDMS/DVB萃取頭。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備

將鯉去頭、去內(nèi)臟、去皮后取背肉，做好標(biāo)記放入自封袋中于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.3.2 感官評定-二點(diǎn)差別檢驗(yàn)法

隨機(jī)同時(shí)出示DT和CT組魚肉給評定員，要求30名評定員根據(jù)表1對樣品進(jìn)行評定。

表1 二點(diǎn)差別檢驗(yàn)法問答表Tab.1 Two-point difference test question and answer table

1.3.3 呈味核苷酸的測定

呈味核苷酸的測定參考WANG等[7]方法，并稍作修改。稱取樣品5.00 g，加10 mL預(yù)冷的高氯酸(10%，v/v)，均質(zhì)30 s，然后冷凍離心15 min(10 000 r/min，4 ℃)，過濾并收集上清液。加入5 mL預(yù)冷的高氯酸(5%，v/v)洗滌沉淀物，在相同條件下再次離心。重復(fù)上述操作兩次。用KOH將收集的上清液的pH調(diào)至6.5并靜置30 min。然后用超純水定容至50 mL，過0.22 μm濾膜待測。

1.3.4 游離氨基酸的測定

游離氨基酸的測定參考HUANG等[8]方法。將2.00 g樣品與15 mL預(yù)冷的三氯乙酸溶液(15%，v/v)混勻并均質(zhì)30 s，靜置2 h。然后離心15 min(4 ℃，10 000 r/min)。過濾取上清液5 mL，用NaOH調(diào)pH至2.2，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用高純水稀釋。游離氨基酸采用全自動氨基酸分析儀測定分析。

1.3.5 滋味活度值和味精當(dāng)量的計(jì)算

滋味活度值(taste activity value，TAV)是樣品中各呈味物質(zhì)的濃度與其閾值的比值，反映了滋味活性物質(zhì)對魚肉整體滋味的貢獻(xiàn)程度[9]。計(jì)算公式見式(1)：

TAV=C/T

(1)，

式中C代表樣品中滋味物質(zhì)的濃度，T代表該滋味物質(zhì)的閾值。當(dāng)TAV>1時(shí)，表明該滋味活性物質(zhì)對整體滋味貢獻(xiàn)顯著，且成正比。當(dāng)TAV <1時(shí)，表明該滋味物質(zhì)不影響整體風(fēng)味[10]。

味精當(dāng)量(equivalent umami concentration，EUC)是指鮮味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)和呈味核苷酸(IMP，AMP)之間的協(xié)同增強(qiáng)作用相當(dāng)于單一味精(MSG)的濃度[11]。EUC值計(jì)算如式(2)[12]：

EUC=∑ab+1 218×(∑ab)×(∑cd)

(2)

式中EUC單位為(g MSG/100g)；a代表鮮味氨基酸含量(谷氨酸、天冬氨酸)(g/100g)；b代表鮮味氨基酸相對于味精的新鮮度系數(shù)(其中谷氨酸1，天冬氨酸為0.077)；c代表風(fēng)味核苷酸含量(IMP，AMP)(g/100 g)和d代表呈味核苷酸相對于IMP的新鮮度系數(shù)(其中IMP為1，AMP為0.18)；1 218代表協(xié)同常數(shù)。

1.3.6 頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法

頂空固相微萃?。?.00 g切碎的魚肉與5 mL 0.18 g/mL NaCl溶液混合后置于頂空進(jìn)樣瓶中(規(guī)格：20 mL)。樣品在50 ℃(水浴溫度)下萃取40 min；然后將萃取頭插入GC進(jìn)樣口，250 ℃解析5 min。

GC-MS測定：揮發(fā)性化合物測量使用與配備DB-5MS毛細(xì)管柱(60 m×0.32 mm，1 μm)；不分流模式進(jìn)樣。溫度程序參考XIAO等[13]方法。初始溫度從40 ℃開始以5 ℃/min的速率升溫至100 ℃，保持2 min，然后以4 ℃/min的速率升溫至160 ℃，最后以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，電子能量70 eV。

1.3.7 GC-MS數(shù)據(jù)處理

通過Xcalibur軟件對GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。為了保證被檢測組分可靠性，并根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)，查詢NIST和Wily質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對樣品揮發(fā)性物質(zhì)確認(rèn)定性，當(dāng)物質(zhì)正反匹配度均大于800時(shí)(最大值1 000)才予以確認(rèn)。采用面積歸一化法確定揮發(fā)性物質(zhì)的相對百分含量。

1.3.8 相對氣味活性值計(jì)算

本文采用相對氣味活性值(relative odor activity value，ROAV)[14]進(jìn)行分析。定義對樣品整體氣味貢獻(xiàn)最大化合物 ROAV為100，對于樣品中其它揮發(fā)性物質(zhì)ROAV值按公式(3)計(jì)算：

(3)

式中Ci和Cstan分別指每種揮發(fā)性成分和對樣品整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的成分的相對百分比(%)含量；Ti和Tstan分別指文獻(xiàn)中報(bào)告的每種揮發(fā)性成分的氣味閾值和對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的成分的氣味閾值。

1.4 其他數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0(SPSS Inc.，Chicago，USA)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Duncan法表示多重比較的結(jié)果，采用Origin 8.5軟件繪圖(Origin Lab Corp，Hampton，USA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官分析

共有30份有效問答單，在5%的顯著水平上正解數(shù)大于20認(rèn)為兩組樣品有差別。由表2可知，8、9月份的感官正解數(shù)均小于20，說明8、9月的鯉肌肉在兩種養(yǎng)殖環(huán)境下無明顯差異。10月份的感官正解數(shù)為24(>20)，說明在5%的顯著水平上，鯉肌肉有明顯差異，其中22位感官人員通過氣味判斷兩組樣品有差異，2位感官人員通過滋味判斷兩組樣品有差異。

表2 二點(diǎn)差別檢驗(yàn)法問答結(jié)果Tab.2 Two-point difference test question and answer results

2.2 呈味核苷酸分析

IMP是魚肉中重要的鮮味核苷酸，其閾值為25 mg/100 g。AMP可以抑制苦味，產(chǎn)生理想的甜味和鮮味，其閾值為50 mg/100 g。從表3可以看出，7、8、9、10月的DT組和CT組中IMP的TAV>1，說明IMP在整個養(yǎng)殖過程中對鯉的整體滋味貢獻(xiàn)顯著。

2.3 游離氨基酸分析

如表4中的鯉肌肉游離氨基酸含量、閾值與式(1)綜合可知，主要的游離氨基酸(TAV大于等于1)包括：谷氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸。在鮮味氨基酸中，天冬氨酸的TAV小于1，對鯉肌肉的鮮味貢獻(xiàn)較??；主要的鮮味氨基酸是谷氨酸，DT組的谷氨酸含量高于CT組，其中鯉被放在稻田養(yǎng)殖第三個月時(shí)(DT10)的谷氨酸含量達(dá)到了20.04 mg/100 g。鯉肌肉中主要的甜味氨基酸是精氨酸，DT組中的精氨酸含量高于CT組，其中DT10中精氨酸含量達(dá)到了68.84 mg/100 g。稻田養(yǎng)殖可以使鯉肌肉更鮮美、更香甜。組氨酸雖然是苦味氨基酸，但可以增添獨(dú)特的肉香，并有研究發(fā)現(xiàn)，組氨酸有可能會為美味的呈味物質(zhì)[15]。

表4 稻田和池塘組中鯉肌肉游離氨基酸含量Tab.4 Contents of free amino acids in C.carpio meat in paddy field and pond

2.4 EUC和TAV值分析

AMP和IMP存在時(shí)呈現(xiàn)鮮味，且甜味也會有所增強(qiáng)。圖1顯示了不同月份的池塘和稻田養(yǎng)殖鯉的EUC值和TAV的變化。隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長，兩種養(yǎng)殖環(huán)境下鯉肌肉的EUC值和TAV值逐漸升高。其中DT組EUC值的TAV在8、9和10月都高于CT組，說明稻田養(yǎng)殖的鯉鮮味更明顯。K7組鯉的EUC值為1.79 g MSG/100 g，味精當(dāng)量TAV值為59.63 g/100 g。DT組的EUC值大于CT的EUC值，其中DT組在8、9、10月的EUC值分別為2.99、4.71、5.68 g MSG/100 g，味精當(dāng)量TAV值為99.95、156.86、189.20 g/100 g；CT組在8、9、10月的EUC值為2.30、3.89、4.61 g MSG/100 g，味精當(dāng)量TAV值為76.82、129.75、153.65 g/100 g。

圖1 稻田和池塘組鯉肌肉的EUC及TAV值Fig.1 EUC and TAV values of C.carpio meat in paddy field and pond

2.5 揮發(fā)性物質(zhì)分析

不同養(yǎng)殖環(huán)境下鯉肉中揮發(fā)性物質(zhì)的ROAV值如表5，己醛、壬醛、辛醛、癸醛和1-辛烯-3-醇的ROAV值均大于1，對鯉整體風(fēng)味影響較大，通常呈現(xiàn)不愉快的青草味、土腥味和刺激性氣味?；衔锏腞OAV值越大，對整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)就越大，一般認(rèn)為ROAV≥1的物質(zhì)是樣品的主要揮發(fā)性化合物；ROAV值為0.1～1的揮發(fā)物對樣品整體的風(fēng)味起修飾作用[16]。DT組的己醛和壬醛的ROAV值低于CT組，說明稻田養(yǎng)殖的鯉肌肉中不愉快的氣味物質(zhì)對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較少。E-2-辛烯醛和十一醛具有果香、清香和脂肪香氣，存在于DT組且ROAV值均大于1，對DT組的鯉風(fēng)味有貢獻(xiàn)。除此之外，ROAV值為0.1～1的辛醇、2-乙基-1-己醇和D-檸檬烯，對鯉肌肉整體的風(fēng)味起修飾作用[17]。

表5 稻田和池塘組中鯉肌肉揮發(fā)性氣味成分的相對氣味活度值(ROAV)Tab.5 ROAV of volatile odor components of C.carpio meat in paddy field and pond

3 討論

魚肉的滋味受游離氨基酸的組成、含量和閾值的影響[18，19]。另外，游離氨基酸之間以及與呈味核苷酸之間相互作用會使水產(chǎn)品呈現(xiàn)出特有的滋味，如甘氨酸和谷氨酸的協(xié)同作用會使水產(chǎn)品鮮味增加，甘氨酸和丙氨酸與IMP的協(xié)同作用會使水產(chǎn)品的甜味顯著增加[20]。由表4中鯉肉游離氨基酸含量、閾值與式(1)綜合可得，主要的游離氨基酸(TAV>1)有谷氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸。表4顯示在鮮味氨基酸中，天冬氨酸的TAV值小于1，對鯉肉的鮮味貢獻(xiàn)較??；主要的鮮味氨基酸是谷氨酸，其與IMP有協(xié)同增強(qiáng)作用，因此對魚肉的滋味有重要貢獻(xiàn)。兩種養(yǎng)殖環(huán)境下鯉肌肉中氨基酸含量有顯著性差異(P<0.05)，DT組的谷氨酸含量始終高于CT組，說明稻田養(yǎng)殖鯉比池塘養(yǎng)殖鯉更鮮。除此之外，稻田養(yǎng)殖的鯉肌肉EUC及其TAV顯著高于池塘養(yǎng)殖，進(jìn)一步表明稻田養(yǎng)殖鯉比池塘養(yǎng)殖鯉更鮮。通過HS-SPME-GC-MS結(jié)合ROAV值篩選出17種氣味活性物質(zhì)，其中己醛、壬醛、辛醛、癸醛和1-辛烯-3-醇的ROAV值較高。DT組中不愉快的氣味活性物質(zhì)對鯉肌肉風(fēng)味的貢獻(xiàn)更低，進(jìn)而說明稻田養(yǎng)殖的鯉肌肉氣味優(yōu)于池塘養(yǎng)殖。

綜上表明，稻田養(yǎng)殖鯉肌肉更為鮮美，稻田養(yǎng)殖鯉肌肉中不愉快的氣味物質(zhì)含量比池塘養(yǎng)殖鯉肌肉中含量少。