陳冠宇 馮紅超

[摘要] 牙髓干細胞來源于神經(jīng)嵴細胞，與其他來源的干細胞相比，具有更高的神經(jīng)源性潛能。牙髓干細胞可以分化為雪旺細胞、膠質(zhì)細胞以及神經(jīng)元前體細胞，彌補了神經(jīng)元細胞缺乏再生能力的缺陷。牙髓干細胞還可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，修復(fù)和保護神經(jīng)。本文就目前誘導(dǎo)牙髓干細胞神經(jīng)向分化的研究進展作一綜述。

[關(guān)鍵詞] 牙髓干細胞；神經(jīng)細胞；神經(jīng)誘導(dǎo)；誘導(dǎo)因子；神經(jīng)向分化

[中圖分類號] R782? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.02.028

牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）在2000年被Gronthos等[1]首次分離出來并進行鑒定，發(fā)現(xiàn)其具有多向分化的能力，其中就包括神經(jīng)向分化的能力。DPSCs與其他成體干細胞不同，其來源于神經(jīng)嵴，因此具有更高的神經(jīng)源性潛能[2]。據(jù)文獻報道，Martens等[3]從未分化的DPSCs中，檢測出了早期神經(jīng)標志物巢蛋白（Nestin）和波形蛋白，神經(jīng)元標志物β和波形蛋白，神經(jīng)元標志物β和p75，以及星形膠質(zhì)細胞標志物S100蛋白。DPSCs來源廣泛，可從因治療需要而拔除的正畸牙或第三磨牙中獲取，由于離體牙屬于病理性醫(yī)療廢物，不會引起倫理道德上的爭議，且其免疫原性低，排異反應(yīng)小，成為組織工程研究的熱點。

1? 誘導(dǎo)DPSCs神經(jīng)向分化

DPSCs來源于神經(jīng)嵴，這也使DPSCs能夠在沒有預(yù)誘導(dǎo)分化的情況下表達神經(jīng)元標志物，如Nestin、p75等。目前優(yōu)化DPSCs神經(jīng)向分化的方法可以分為兩種，第一種最常用，是將提取的DPSCs與誘導(dǎo)因子在一定條件下進行培養(yǎng)，繼而檢測誘導(dǎo)因子對DPSCs中神經(jīng)因子表達的調(diào)控作用，最后得出DPSCs向神經(jīng)樣細胞分化的結(jié)論。第二種則是有部分學(xué)者通過采取改變培養(yǎng)條件的方法來優(yōu)化DPSCs神經(jīng)向分化。

1.1? 通過誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)DPSCs神經(jīng)向分化

獲取原代DPSCs后，在其傳代和培養(yǎng)過程中，加入神經(jīng)誘導(dǎo)因子，以此促進DPSCs的神經(jīng)向分化是一種比較常用的誘導(dǎo)方法，常用的神經(jīng)誘導(dǎo)因子有堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，bDNF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等。有文獻報道，在對DPSCs經(jīng)過神經(jīng)誘導(dǎo)后，細胞向神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞分化。尼爾樣-1型分子（Nel-like molecule-1，Nell-1）不僅可以促進成牙本質(zhì)細胞的分化和牙本質(zhì)的形成，而且其本身還可以與神經(jīng)標志物共同表達[4]。研究表明，Nell-1在誘導(dǎo)DPSCs向神經(jīng)樣細胞分化中起積極作用[5]，如大鼠的牙髓組織在經(jīng)過Nell-1作用后，P物質(zhì)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）和Nestin等神經(jīng)標志物的表達明顯增加；在通過對Nell-1誘導(dǎo)后的人DPSCs的檢測中，發(fā)現(xiàn)其膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、Nestin和β-tubulin等神經(jīng)標志物的表達也有明顯增加。

bFGF作為常用的神經(jīng)誘導(dǎo)因子，在誘導(dǎo)DPSCs神經(jīng)向分化的研究中也較為多見，例如Rafiee等[6]通過利用肝素來穩(wěn)定bFGF，以此提高bFGF因子的存活率，從而更好地誘導(dǎo)DPSCs神經(jīng)向分化；另外一項研究則是使用3D多孔殼聚糖支架為DPSCs的存活和神經(jīng)分化提供了適宜的環(huán)境，并發(fā)現(xiàn)在將殼聚糖支架聯(lián)合bFGF應(yīng)用時，可促進DPSCs的神經(jīng)向分化[7]；而在Farhang等[8]的研究中，則是分別使用了bFGF和音猬因子（sonic hedgehog，SHH）兩種神經(jīng)誘導(dǎo)因子，結(jié)果表明在懸滴法培養(yǎng)條件下使用SHH誘導(dǎo)培養(yǎng)后的DPSCs分化為神經(jīng)元樣細胞的效率更高。鄧軒等[9]在對人乳牙牙髓干細胞的研究中，miR-20通過激活骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路，從而促進牙髓干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化。近期有學(xué)者成功的從人的牙髓中提取出脫細胞基質(zhì)水凝膠（hydrogel derived from human dental pulp，hDDPM-G）[10]，并將DPSCs接種在hDDPM-G涂層表面上，通過含有bFGF的預(yù)誘導(dǎo)液對進行培養(yǎng)后，再使用神經(jīng)誘導(dǎo)液（含羥基苯甲醚、毛喉素、β-巰基乙醇等誘導(dǎo)因子）進行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)hDDPM-G能夠更好地激發(fā)DPSCs的分化潛能，誘導(dǎo)DPSCs分化為神經(jīng)樣細胞，而且這種方法減少了牙髓組織的使用量，為誘導(dǎo)DPSCs神經(jīng)向分化提供了一個優(yōu)化方案。綜上，研究人員需要更系統(tǒng)和廣泛的研究，探索不同誘導(dǎo)因子對DPSCs神經(jīng)向分化的誘導(dǎo)效率，闡明各種誘導(dǎo)因子對DPSCs神經(jīng)向分化的的關(guān)鍵作用和相關(guān)機制，從而探究最佳的神經(jīng)誘導(dǎo)條件。

1.2? 優(yōu)化培養(yǎng)條件促進DPSCs神經(jīng)向分化

多數(shù)學(xué)者在研究DPSCs的神經(jīng)向分化時，常常局限于對誘導(dǎo)因子的使用，但有文獻報道顯示，當(dāng)使用的誘導(dǎo)因子不變時，比較常規(guī)培養(yǎng)基和無血清條件的培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)的DPSCs，發(fā)現(xiàn)無血清培養(yǎng)條件下DPSCs衍生的神經(jīng)球中的表達比常規(guī)培養(yǎng)條件下的DPSCs中更顯著[11]。Farhang等[8]在DPSCs神經(jīng)向誘導(dǎo)的實驗中，發(fā)現(xiàn)懸滴法（3D細胞培養(yǎng)法）比組織培養(yǎng)板（2D細胞培養(yǎng)法）條件下誘導(dǎo)的DPSCs具有更高的神經(jīng)源向潛能。Luzuriaga等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)，使用bDNF聯(lián)合神經(jīng)營養(yǎng)因子3（neurotrophins-3，NT-3）誘導(dǎo)DPSCs神經(jīng)向分化時，無血清培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的DPSCs比在10%胎牛血清誘導(dǎo)的DPSCs向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化的潛力大大增加。另外，現(xiàn)有的研究主要是在一些特殊條件（高糖、缺氧等）下對DPSCs進行成牙本質(zhì)向分化，成骨分化[等方面的誘導(dǎo)[13-14]，或是在特殊條件檢測DPSCs的分化潛能[15]，對DPSCs神經(jīng)向分化的研究較少，Matsumura等[16]等發(fā)現(xiàn)缺氧條件下經(jīng)過神經(jīng)誘導(dǎo)的DPSCs更具有活力。

2? 關(guān)于DPSCs不同的神經(jīng)誘導(dǎo)方案

在DPSCs神經(jīng)向誘導(dǎo)的研究中，雖然已經(jīng)取得了相當(dāng)不錯的進展，但是仍存在很多障礙。多項研究利用神經(jīng)誘導(dǎo)體系已經(jīng)成功誘導(dǎo)DPSCs神經(jīng)向分化[5-7，10-11，17-18]，Nestin和βstin10，11作為主要的神經(jīng)元標志物，許多研究在鑒定DPSCs是否具有神經(jīng)向分化能力時，都對其進行了檢測，且在誘導(dǎo)后兩種標志物的表達都得到了顯著提升，這使得對Nestin和βstin到了顯著提的檢測結(jié)果成為了鑒定DPSCs是否神經(jīng)向分化有力證據(jù)之一。另外，Guo等[19]的研究表明通過基因敲除熱休克蛋白27，可以促使DPSCs分化為少突膠質(zhì)前體細胞。Stanwick等[20]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子受體2（transforming growth factor receptor 2，TGFBR2）的缺失減少了DPSCs神經(jīng)軸突的生長，并推斷TGFBR2在牙齒礦化和神經(jīng)支配過程中具有引導(dǎo)神經(jīng)軸突生長的能力。階段特異性胚胎抗原4（stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4）是鑒定多能胚胎干細胞的標志物之一，有研究表明，對SSEA-4呈陽性的人類脫落乳牙牙髓干細胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）在經(jīng)過神經(jīng)誘導(dǎo)后，其在形態(tài)和功能上都與神經(jīng)元前體細胞類似[21]。但是在眾多的神經(jīng)誘導(dǎo)方法中，哪種方法是最成功、最高效、最適合推廣的，目前無法得出一個準確的結(jié)論。既往研究結(jié)果表明DPSCs神經(jīng)向誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物中產(chǎn)生了表達神經(jīng)元標志物的神經(jīng)元樣細胞，在形態(tài)和功能上具有相似的生物學(xué)行為，但無法證實其為真正意義上的神經(jīng)元細胞。

3? DPSCs參與神經(jīng)修復(fù)

神經(jīng)損傷是一種常見的疾病，可能是外傷、腫瘤手術(shù)、感染等因素所致。神經(jīng)損傷后難以自我恢復(fù)，主要是因為神經(jīng)元細胞缺乏再生能力，神經(jīng)營養(yǎng)因子生成不足，細胞處于神經(jīng)生長抑制因子分泌的環(huán)境。一直以來，神經(jīng)損傷的修復(fù)都是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點和難點。

關(guān)于DPSCs在神經(jīng)修復(fù)及神經(jīng)系統(tǒng)性疾病上的應(yīng)用，目前大多數(shù)的研究是在動物模型上進行，并且在脊髓損傷[22]、阿爾茨海默癥[23]、帕金森病[24]的治療上取得了一些成效，也證明了DPSCs非常有希望成為修復(fù)神經(jīng)損傷以及治療神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的干細胞來源[6]。例如，Takaoka等[25]將DPSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)譜系細胞（neural lineage cells，NLCs）后，移植到免疫缺陷大鼠體內(nèi)，觀察到NLCs軸突伸長，髓鞘再生，并且大鼠的肌肉萎縮得到改善。有研究表明，在腦梗小鼠模型的實驗中，與DPSCs相比，N-DPSCs的移植能夠更好的改善腦梗死后的功能恢復(fù)[16]。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過神經(jīng)誘導(dǎo)的DPSCs（neural-induced DPSCs，N-DPSCs）分泌物可以促進雪旺細胞的增殖，并證實N-DPSCs和DPSCs均能促進大鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后運動功能的恢復(fù)。Luo等[26]的研究表明，與單獨使用DPSCs相比，DPSCs聯(lián)合bFGF在修復(fù)中樞神經(jīng)損傷方面能夠更好的促進神經(jīng)元再生以及大鼠脊髓損傷后的功能恢復(fù)。DPSCs和SHEDs的分泌蛋白質(zhì)組，即在條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）或細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）中釋放的所有生物活性分子，CM和EV均能夠刺激神經(jīng)突生長，并在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和神經(jīng)元損傷的動物模型中表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用[27]。這些研究證明了DPSCs促進神經(jīng)修復(fù)的能力，也為再生醫(yī)學(xué)提供了寶貴的資源，但在研究人員進入臨床試驗之前，必須更加徹底地研究不同物種DPSCs的生物學(xué)特性和免疫學(xué)基礎(chǔ)。

DPSCs修復(fù)神經(jīng)的機制目前尚不明確，無論是通過DPSCs直接分化為神經(jīng)元樣細胞來補充損失的神經(jīng)細胞，還是通過DPSCs分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子作用于病損區(qū)的神經(jīng)細胞來修復(fù)神經(jīng)，都沒有獲得充分的理論依據(jù)支持。綜上所述，在DPSCs的分離、培養(yǎng)、神經(jīng)向誘導(dǎo)以及臨床應(yīng)用等各方面，無不充斥著這項研究未來所面臨的挑戰(zhàn)和困難。

4? 展望

基于DPSCs的研究為組織再生領(lǐng)域帶來了光明的未來，尤其是DPSCs的神經(jīng)向分化更是為神經(jīng)修復(fù)及神經(jīng)疾病的治療帶來了巨大希望。DPSCs不僅更容易獲取，而且與神經(jīng)細胞共同來源于神經(jīng)嵴，因此DPSCs比其他干細胞來源具有更良好的應(yīng)用前景，是治療神經(jīng)損傷的理想干細胞來源。

目前，隨著生物材料廣泛用于組織再生，組織再生領(lǐng)域也出現(xiàn)了一線新機，將干細胞工程與生物材料相結(jié)合，也為神經(jīng)修復(fù)指明了一個新的方向。在利用DPSCs進行神經(jīng)修復(fù)的研究時，最常采用的生物學(xué)材料是糖[7]，另外，如硅膠管[28]、肝素-泊洛沙姆水凝膠[29]、3D納米纖維支架[30]等其他生物學(xué)材料也時有報道。Drewry等[31]使用神經(jīng)向誘導(dǎo)的DPSCs及細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）設(shè)計了無生物活性支架的細胞片，DPSCs可以分泌高水平的神經(jīng)營養(yǎng)因子，ECM可以促進軸突延伸，應(yīng)用于面神經(jīng)損傷時可以與神經(jīng)導(dǎo)管結(jié)合使用，以增強其生物活性或形成獨立的無支架神經(jīng)導(dǎo)管，進一步改善面神經(jīng)的恢復(fù)。總之，這些研究提供了關(guān)于DPSCs與生物學(xué)材料相結(jié)合并應(yīng)用于神經(jīng)修復(fù)或再生的信息，并為開發(fā)應(yīng)用于神經(jīng)修復(fù)或再生的新生物材料提供了難得的寶貴經(jīng)驗。國內(nèi)有研究采用3D懸滴培養(yǎng)技術(shù)對前列腺上皮細胞、間充質(zhì)干細胞、DPSCs進行培養(yǎng)，并發(fā)現(xiàn)3D懸滴培養(yǎng)法獲取的細胞數(shù)量與2D貼壁培養(yǎng)法相比，獲得了顯著提升[32-33]。另外，SASAKI等[28]采用三維模擬微重力培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的DPSCs與靜態(tài)3D技術(shù)培養(yǎng)相比，不僅在細胞數(shù)量上有顯著提升，而且在細胞的分化潛能（特別是向成牙本質(zhì)細胞分化）上也明顯提高，但并未對其神經(jīng)向分化能力進行檢測，這尚需要進行更進一步的研究。

總之，自2000年DPSCs被發(fā)現(xiàn)后，經(jīng)過國內(nèi)外學(xué)者的不斷探索和深入研究，DPSCs在修復(fù)神經(jīng)損傷以及治療神經(jīng)系統(tǒng)性疾病等方面的應(yīng)用已經(jīng)得到了極大的發(fā)展，但就目前而言，將其真正應(yīng)用到臨床還為時尚早，仍需要先弄清DPSCs修復(fù)神經(jīng)的機制，進一步提高DPSCs神經(jīng)向分化的效率，并結(jié)合現(xiàn)有的科技及生物學(xué)材料，將研究成果實際應(yīng)用于神經(jīng)疾患的臨床治療，任重而道遠。

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（收稿日期：2022-07-30）

（修回日期：2022-12-04）