張佳陽　李紅男　劉潤生　曲明海　邢雪琨

【摘要】? 肝臟缺血再灌注會引起細(xì)胞損傷和器官功能障礙。間充質(zhì)干細(xì)胞外囊泡作為細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信息傳遞的載體，在肝臟抗氧化應(yīng)激、促進(jìn)組織修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用。不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞外囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)效果不同，已有的細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)證明間充質(zhì)干細(xì)胞外囊泡有助于改善肝臟缺血再灌注損傷。本文從間充質(zhì)干細(xì)胞外囊泡對肝臟缺血再灌注機(jī)制的研究展開綜述，探討其發(fā)揮的重要作用。

【關(guān)鍵詞】? 肝臟缺血再灌注；間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞外囊泡

中圖分類號? R329.2? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2023）01--04

Research progress of extracellular vesicles of mesenchymal stem cells involved in hepatic ischemia-reperfusion Zhang Jiayang， Li Hongnan， Liu Runsheng， Qu Minghai， Xing Xuekun.School of Public Health， Guilin Medical University，Guilin 541199， China

【Abstract】? Liver ischemia-reperfusion can cause cell damage and organ dysfunction. Study found that mesenchymal stem cells outside the vesicles as a material transfer and information transmission between the cells of the carrier， to promote tissue repair in liver oxidative stress resistance， play a role in such aspects， ectomesenchymal stem cells from different sources outside the vesicle transport effect is different， the existing cell and animal experiments proved vesicle helps to improve liver ischemia-reperfusion injury. It will bring a new direction to the experiments of exocyst administration of mesenchymal stem cells after liver transplantation. This article reviews the mechanism of hepatic ischemia-reperfusion induced by extracellular vesicles of mesenchymal stem cells and discusses its important role.

【Key words】? ?Ischemia reperfusion; Mesenchymal stem cells; Extracellular vesicle

肝臟缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）指肝臟在血流阻斷（缺血）基礎(chǔ)上恢復(fù)血流灌注所引起的細(xì)胞損傷和器官功能障礙，失血性休克、肝臟切除術(shù)和肝移植術(shù)等均可誘發(fā)肝臟IRI，其也是肝臟手術(shù)中導(dǎo)致肝損傷的主要原因之一[1-3]。隨著外科手術(shù)技術(shù)、免疫抑制技術(shù)和圍手術(shù)期護(hù)理技術(shù)的提高，肝移植術(shù)已發(fā)展成為各種終末期肝病的有效治療方法之一。目前，肝移植術(shù)已經(jīng)在全球80多個國家開展，盡管接受肝移植術(shù)治療的患者術(shù)后1年生存率超過80%[4]，但I(xiàn)RI仍是影響肝移植患者預(yù)后的主要原因之一[5]。IRI誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷與肝移植術(shù)后早期移植物功能不良相關(guān)，甚至能誘導(dǎo)移植肝原發(fā)性無功能的發(fā)生[5]。肝臟IRI可導(dǎo)致細(xì)胞因子、趨化因子釋放，活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高，除引起肝臟本身損傷外，還可導(dǎo)致遠(yuǎn)端器官如腎臟、腎上腺、肺臟、胰腺、腸道的損傷[6]。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞外囊泡的作用及區(qū)別

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作為高度分化的多功能細(xì)胞，其成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性能進(jìn)入各種中胚層體系，主要來源包括骨髓、臍帶、肌肉和脂肪組織等[7-9]。MSCs被國際干細(xì)胞研究學(xué)會定義為塑料黏附細(xì)胞，在標(biāo)準(zhǔn)條件下具有附著的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，在標(biāo)準(zhǔn)體外分化條件下可分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。MSCs不表達(dá)人類白細(xì)胞抗原Ⅱ類分子，使其能夠逃避異基因免疫問答，這一“免疫特權(quán)”使MSCs非常適合自體移植和同種異體移植[10-11]。

不同于MSCs具有多向分化能力和發(fā)生腫瘤的潛能，MSCs外囊泡（extracellular vesicles from MSCs，MSCs-EV）可降低致癌風(fēng)險?；诋?dāng)前的生物起源，細(xì)胞外囊泡可以大致分為兩類：外泌體和微泡。外泌體直徑一般為50～150nm，微泡直徑為50～500nm（最大至1μm）[12]。考慮到MSCs的異質(zhì)性，不同來源MSCs的免疫調(diào)節(jié)和血管生成作用不同[13]。目前在臨床試驗(yàn)中使用MSCs仍存在爭議，且尚不清楚MSCs治療肝病的最佳劑量。有研究表明，大劑量MSCs輸注后可引起肺栓塞，而MSCs-EV較小且比MSCs更穩(wěn)定，在儲存和運(yùn)輸過程中也更容易對質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行控制[14]。

2? MSCs-EV抗炎癥反應(yīng)

骨髓MSCs-EV可以減少組織損傷，MSCs-EV在體內(nèi)和體外均能降低炎癥介質(zhì)的表達(dá)，通過釋放內(nèi)源性危險信號來調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)快速啟動無菌炎癥反應(yīng)對抗可能導(dǎo)致的肝臟IRI。胱天蛋白酶1（caspase-1）和炎癥小體依賴性通路可能參與肝臟IRI，NOD樣受體（NOD-like receptors，NLR）是一類重要的細(xì)胞液模式識別受體，它負(fù)責(zé)激活一些內(nèi)部分子，例如識別細(xì)胞內(nèi)危險相關(guān)分子模式的響應(yīng)病原體，導(dǎo)致NOD樣受體家族含Pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3（NOD-like receptor family Pyrin domain-containing protein，NLRP）、NLRP4等炎癥小體的形成，白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β前體和IL-18作為炎癥和細(xì)胞死亡反應(yīng)的重要介質(zhì)，受caspase-1激活后形成，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15-17]。有觀察結(jié)果表明[18-19]，MSCs-EV的作用不是通過直接影響促炎性NLR表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，而是通過NLRP12減輕炎癥，NLRP12是一種通過減弱非典型核因子κB信號在體外免疫系統(tǒng)和其他環(huán)境下炎癥活動的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。它在炎癥應(yīng)激時，可以起到肝臟保護(hù)作用，即使MSCs-EV增加了多個NLR的表達(dá)，但I(xiàn)L-1β的表達(dá)在MSCs-EV參與的IRI過程中降低，靶向NLRP12介導(dǎo)的抗炎反應(yīng)來調(diào)節(jié)肝臟IRI作為一種治療策略值得進(jìn)一步探討。

在實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中，MSCs-EV可在減輕與組織損傷相關(guān)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用，MSCs-EV可以抑制肝細(xì)胞中NF-κB活性，如IL-6和IL-1β是由NF-κB激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子的表達(dá)而生成[20]。MSCs-EV可增加小鼠正常肝細(xì)胞（AML12）體外釋放CXCL1。CXCL1 mRNA在肝臟IRI過程中表達(dá)增加，并由MSCs-EV增強(qiáng)進(jìn)一步表達(dá)。此外，CXCL1可直接增加肝細(xì)胞增殖[21-22]。因此，CXCL1可能參與損傷后的組織修復(fù)反應(yīng)。雖然還沒有確鑿的證據(jù)，但肝臟CXCL1表達(dá)增加可能有助于募集釋放NLRP12的細(xì)胞。減少肝臟IRI可以增加邊緣肝臟如來自擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)供體的使用，并增加供者器官庫的可用性，從而降低晚期肝病的死亡率，以上研究支持來源于MSCs的EVs用于治療減輕肝臟手術(shù)或肝移植術(shù)后肝臟IRI[23-24]。

3? 不同來源MSCs-EV的作用機(jī)制

3.1? 臍帶MSCs

Zheng等[25]表明臍帶MSCs外囊泡通過分泌一種新型聚集自噬受體——含TCP1伴侶蛋白亞基2發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，抑制CD4+ T細(xì)胞上CD154的表達(dá)從而保護(hù)肝臟。此外，這種有益作用可能主要與EVs的含TCP1伴侶蛋白亞基2影響鈣通道，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，抑制活化T細(xì)胞核因子1向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移有關(guān)。CD154是一種短暫性蛋白，在CD4+ T細(xì)胞中表達(dá)，是IRI中不可或缺的肝損傷和肝炎癥因子；活化T細(xì)胞核因子1是調(diào)控T細(xì)胞分化、活化、耗竭和自我耐受的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[26-29]。

使用抗體CD40或敲除CD154在體內(nèi)表達(dá)有助于抑制炎癥反應(yīng)[27]。有研究發(fā)現(xiàn)[25]，在炎癥刺激6 h后CD4+ T細(xì)胞表達(dá)達(dá)到高峰，CD154表達(dá)也明顯增加，從而激活CD4+ T細(xì)胞并與其同源受體CD40相互作用刺激適應(yīng)性和先天免疫系統(tǒng)，用抗體CD40或敲除CD154治療的目的是在早期抑制CD154表達(dá)，阻斷炎癥反應(yīng)的中間過程以改善肝臟IRI。

肝細(xì)胞敲除Yes-相關(guān)蛋白可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷，Iverson等[30]通過構(gòu)建非酒精性脂肪肝小鼠模型Albumin-Cre小鼠與Yapflox小鼠，觀察這些小鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高水平和病理肝改變，提示Yes-相關(guān)蛋白不表達(dá)在聚集性肝臟IRI中起關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)一種新的Yes-相關(guān)蛋白激活的機(jī)制是通過CD47/CD172a通路激活影響肝臟外囊泡的釋放，CD47通過靶向CD172a富集外囊泡可能是治療肝臟IRI的一種新策略[31]。

3.2? 肝臟MSCs

人肝干細(xì)胞來源外囊泡在體內(nèi)可保護(hù)肝臟免受IRI的影響，Calleri等[32]驗(yàn)證了其在缺血持續(xù)90min的小鼠肝臟IRI中存活，并使用人肝干細(xì)胞來源外囊泡成功促進(jìn)了70%肝切除小鼠模型的肝再生。實(shí)驗(yàn)中分別使用高低兩種劑量的外囊泡，高劑量組與對照組谷丙轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶比較無差異，存活時間無明顯差異，提示高劑量外囊泡不能保護(hù)肝臟免受IRI的影響，低劑量組結(jié)果表明在人肝干細(xì)胞來源外囊泡處理后，谷丙轉(zhuǎn)氨酶釋放明顯增加，對缺血損傷的肝細(xì)胞有較強(qiáng)的保護(hù)作用[32]。有證據(jù)顯示，人肝干細(xì)胞來源外囊泡在80℃下保存6個月才失去生物活性，表明它們比干細(xì)胞的儲存時間更長[33]。

3.3? 骨髓MSCs

在肝缺血再灌注發(fā)生時，高遷移率族蛋白B1釋放到細(xì)胞外空間，通過Toll樣受體釋放信號和損傷相關(guān)細(xì)胞因子來激活促炎癥反應(yīng)[34]，在嚙齒類動物模型中使用高遷移率族蛋白B1中和抗體，通過下調(diào)高遷移率族蛋白B1 siRNA表達(dá)水平，有效保護(hù)肝臟缺血再灌注損傷組織[35]。IL-1可誘導(dǎo)肝臟中細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)從而影響中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)[35-36]，而抗體抗細(xì)胞間黏附分子-1可預(yù)防中性粒細(xì)胞外滲，明顯減輕肝損傷[37]。有研究對比分析了骨髓來源MSCs和MSCs衍生外囊泡與人類成年真皮成纖維細(xì)胞及衍生外囊泡在小鼠肝IRI后期模型[38-39]，發(fā)現(xiàn)與用成纖維細(xì)胞及衍生外囊泡處理小鼠相比，在此前先靜脈注射MSCs和MSCs衍生的外囊泡肝缺血導(dǎo)致的肝損傷顯著減輕。綜合數(shù)據(jù)顯示，成纖維細(xì)胞或成纖維細(xì)胞衍生的外囊泡在IRI后不能防止肝損傷，而MSCs和MSCs衍生外囊泡有望成為未來IRI的治療方法。

4? 小結(jié)

MSCs-EV作為載體，在轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)方面發(fā)揮了重要作用，不同來源的MSCs-EV轉(zhuǎn)運(yùn)效果也不同。以上從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)機(jī)制方面闡述了不同來源的MSCs-EV在肝臟缺血再灌注中的作用，使用MSCs-EV促進(jìn)肝組織修復(fù)在許多不同的模型中得到驗(yàn)證，為其臨床修復(fù)肝損傷帶來新的可能。由于大多數(shù)研究采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和小鼠模型來進(jìn)行，尚處于研究階段，所涉及的一些通路和作用機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。未來MSCs-EV將會給肝臟IRI帶來新的希望，特別是應(yīng)用于臨床研究，尋求其中特異性治療靶點(diǎn)。

5? 參考文獻(xiàn)

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[2022-08-12收稿]