林春松，黃青云，張雪芹，趙克旺，劉鴻洲，徐夙俠*

（1.福建省亞熱帶植物研究所/福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室，福建 廈門 361006；2.臨夏州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘肅 臨夏 731100）

款冬花是我國傳統(tǒng)中藥材，為菊科款冬屬植物款冬(Tussilago farfara L.)的干燥花蕾，其味辛、微苦，性溫，歸肺經(jīng)，具有潤肺下氣、止咳化痰的功效，傳統(tǒng)上用于治療新久咳嗽、喘咳多痰、勞嗽咯血等癥［1］。研究表明，款冬花在抗腫瘤、抗氧化、抗菌、減肥、神經(jīng)保護等多個方面具有良好的藥理活性。款冬花的化學(xué)成分主要有萜類、黃酮類、酚酸類、甾醇類、生物堿［2］。據(jù)李瑋等報道［3-4］，款冬花中含量較高且具有良好藥理活性的有效成分是款冬酮、蘆丁、綠原酸類（綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C）。

近年來，隨著對中藥研究的不斷深入，作為構(gòu)成植物體內(nèi)基本組成成分的礦質(zhì)元素也引起了眾多學(xué)者的重視。植物吸收的礦質(zhì)元素包括大量營養(yǎng)元素（氮、磷、鉀）、中量營養(yǎng)元素（鈣、鎂、硫）、微量營養(yǎng)元素（鐵、錳、銅、鋅、硼、鉬、氯等）和有益元素（硒、鈉、稀土元素），這些元素在植物的各項生理代謝過程具有重要的調(diào)控作用［5］，不僅影響藥效成分的形成和積累，而且與藥材自身的藥效也緊密相關(guān)［6-7］。

款冬花在我國甘肅、山西、河北等地均有較大規(guī)模種植。甘肅臨夏回族自治州自然氣候變化多樣，2/3的耕地分布在高寒陰濕、干旱和二陰地區(qū)，其南部的積石山、和政、康樂、臨夏等州縣適宜款冬花生長，是款冬花的生態(tài)適宜區(qū)［8-9］。

本文通過測定臨夏不同產(chǎn)地款冬花中有效成分及礦質(zhì)元素的含量，比較不同產(chǎn)地的差異，并通過雙變量相關(guān)性分析研究了款冬花中有效成分與礦質(zhì)元素間的關(guān)系，以期揭示影響款冬花活性成分含量的主導(dǎo)因子，為款冬花生態(tài)種植的合理施肥和品質(zhì)提升提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

10個產(chǎn)地共30份供試樣品采自臨夏州南部縣的不同村組，分別為：（1）HZ1（和政縣卜家莊鄉(xiāng)卜家莊）、（2）HZ2（和政縣馬家堡鄉(xiāng)馬家堡）、（3）HZ3（和政縣官灘溝鄉(xiāng)官灘溝）、（4）JSS1（積石山縣中咀嶺鄉(xiāng)廟嶺村）、（5）JSS2積石山縣癿蔵鎮(zhèn)納莫溝村、（6）LX1（臨夏縣漫路鄉(xiāng)漫路村）、（7）LX2（臨夏縣漫路鄉(xiāng)小溝門村）、（8）KL1（康樂縣五戶鄉(xiāng)朱家村），（9）KL2（康樂縣五戶鄉(xiāng)四社）、（10）KL3（康樂縣五戶鄉(xiāng)陰山）。所有樣品均經(jīng)福建省亞熱帶植物研究所鑒定為款冬的干燥花蕾。

1.2 試劑、儀器與設(shè)備

使用的試劑包括：新綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma-Aldrich（美國密歇根州圣路易斯）；綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸A、新綠原酸B、新綠原酸C購自成都Mann-Stewart生物技術(shù)有限公司；蘆丁和款冬酮購自德思特生物技術(shù)有限公司；甲醇為分析純，購自吉安豪邁精細化工實業(yè)有限公司；乙醇為分析純，購自西隴科學(xué)股份有限公司；甲酸為分析純，購自上海麥克林生化公司；乙腈為色譜純，購自Tedia公司（美國）。元素標(biāo)準(zhǔn)溶液均購自安捷倫公司（美國），其中混標(biāo)1：內(nèi)含鉀(K)、鈣(Ca)、鈉(Na)、鎂(Mg)、鐵(Fe)各1000 μg/mL；混標(biāo)2：內(nèi)含鋁(Al)、錳(Mn)各100 μg/mL；混標(biāo)3：內(nèi)含鋰(Li)、釩(V)、鉻(Cr)、鈷(Co)、鎳(Ni)、銅(Cu)、鋅(Zn)、銣(Rb)、鍶(Sr)、鎘(Cd)、銫(Cs)、鋇(Ba)、鉛(Pb)、鈾(U)各10 μg/mL；混標(biāo)4：內(nèi)含硼(B)、磷(P)、鈦(Ti)、鍺(Ge)、鋯(Zr)、鉬(Mo)各10 μg/mL。

使用的儀器包括：Waters Acquity UPLC儀(Waters，包括Waters Acquity BEH C18色譜柱、自動進樣器、Binary溶劑管理系統(tǒng)，二極管陣列檢測器DAD，柱溫箱和化學(xué)工作站）；Milli-Q Direct 8水純化系統(tǒng)（法國）；BS124S、BS423S Sartorius電子天平（德國）；SB25-12DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DK-80型電熱恒溫器（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；KDM型調(diào)溫電熱套（山東華魯電熱儀器有限公司）；電感耦合等離子體光譜儀iCAP 7200(Thermo)；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀iCAPQ(Thermo)；元素分析儀Flash 2000 CHNS/O(Thermo Fisher)。

1.3 綠原酸類成分、蘆丁和款冬酮的含量測定

1.3.1 供試品溶液的制備 綠原酸類及蘆丁測試樣品的制備：將款冬花樣品粉碎過80目篩，精密稱定1 g樣品，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇20 mL，稱重，超聲處理1 h，放冷，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻后過45 μm孔徑濾膜制得。

款冬酮測試樣品的制備：款冬花過80目篩，精密稱定1 g樣品，置具塞錐形瓶中，加入乙醇20 ml，稱重，超聲處理1 h，放冷，用乙醇補足減失的重量，搖勻后過45 μm孔徑濾膜制得。

1.3.2 色譜條件 綠原酸類成分、蘆丁和款冬酮均采用超高效液相色譜法(UPLC)測定，綠原酸類成分、蘆丁測試色譜條件：色譜柱為Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm），柱溫35℃，流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈，流速0.3 mL/min。洗脫條件：0~5 min，A相由90%線性變化為75%；5~6.5 min，A相75%線性變化為45%；6.5~9 min，A相由45%線性變化為15%。DAD檢測器。款冬酮測試色譜條件：色譜柱為Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，柱溫35 ℃，以甲酸+水（85∶15）為流動相，檢測波長220 nm。標(biāo)準(zhǔn)品及典型樣品的色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（a、c）和款冬花樣品溶液（b、d）的UPLC圖譜

1.4 礦質(zhì)元素的測定

款冬花樣品用自來水洗凈，再用去離子水漂洗，置電熱恒溫干燥箱中以50 ℃烘至恒重，用瑪瑙研缽研細，樣品過100目篩。測定款冬花樣品中的28種礦質(zhì)元素，N采用動態(tài)閃燒確定含量，爐950℃（逐步升溫：400、600、800、950 ℃），柱箱65 ℃，載氣設(shè)為140 mL/min，參考氣設(shè)為100 mL/min吹掃進樣口，進樣延遲12 s，氧氣設(shè)為250 mL/min，注入5 s；K、Ca、Na、Mg的含量采用電感耦合等離子體光譜ICP-OES測定，以HNO3為消解體系對樣品進行高壓罐消解，RF Power 1150 W，霧化氣流速0.5 L/min，冷卻氣流速12.0 L/min，輔助氣流速0.5 L/min，吹掃氣流速trickle（微量）；Fe、Al、Mn、Li、V、Cr、Co、Ni、Cu、Zn、Rb、Sr、Cd、Cs、Ba、Pb、U、B、P、Ti、Ge、Zr、Mo采用電感耦合等離子體質(zhì)譜ICPMS測定，以HNO3為消解體系對樣品進行高壓罐消解，等離子體射頻功率1400 W；霧化氣（氬氣）體積流量1.08 L/min；等離子流量14 L/min；霧化室溫度3 ℃；重復(fù)采集3次，結(jié)果取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2010軟件進行整理；運用SPSS 23.0軟件的Pearson相關(guān)系數(shù)法對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨夏不同產(chǎn)地款冬花中有效成分含量特征

10個不同產(chǎn)地款冬花樣品的有效成分含量見表1。按照藥典中規(guī)定的質(zhì)量分析指標(biāo)成分要求，款冬酮含量除樣品HZ2、JSS1外，其余樣品均達到標(biāo)準(zhǔn)值；在綠原酸類成分中，綠原酸含量最高，其次依次是異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、隱綠原酸、新綠原酸。通過對比不同產(chǎn)地的測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HZ1的款冬酮、綠原酸、異綠原酸A含量最高；LX2的異綠原酸B、異綠原酸C及新綠原酸含量最高；LX1的隱綠原酸含量最高；HZ2的款冬酮和蘆丁含量最低；HZ3的款冬酮含量高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，但所有的綠原酸類成分的含量均為最低。

表1 臨夏不同產(chǎn)地款冬花樣品的有效成分質(zhì)量分數(shù) mg/g

2.2 臨夏不同產(chǎn)地款冬花礦質(zhì)元素的含量特征

10個產(chǎn)地樣品的礦質(zhì)元素的檢測結(jié)果見表2。臨夏不同產(chǎn)地款冬花礦質(zhì)元素的含量從高至低依次排序為K、N、Ca、P、Mg、Al、Fe、Na、Ti、Mn、Rb、B、Ba、Sr、Zn、Cu、Cr、V、Ni、Li、Zr、Pb、Mo、Cs、Co、Ge、Cd、U。HZ1樣品中N、Na、K、P、Cu、Rb、Mo的含量最高，Ca、Fe、Al、Ti、Li、V、Cr、Mn、Co、Ni、Ge、Zr、Cd、Ba、Pb、U的含量最低；KL1樣品中Mg、Fe、Al、Ti、Mn、Co、Ge、Zr、Cs的含量最高；HZ2樣品中Ca、Ba、Pb、U的含量最高，N、K、P含量最低；HZ3樣品中Li、B的含量最高，Na，Sr含量最低；JSS1樣品中Sr的含量最高，B、Zn、Rb的含量最低，JSS2樣品中Cr、Ni、Cd的含量最 高；LX1樣 品中Mg、Cu、Cs的含量最低；LX2樣品中V、Zn的含量最高，Mo的含量最低。根據(jù)國家藥典委員會發(fā)布的《中國藥典》2020年版四部中9302中藥有害殘留物限量制定指導(dǎo)原則，Cu、Cd、Pb均未超標(biāo)。

表2 臨夏不同產(chǎn)地款冬花中礦質(zhì)元素的質(zhì)量分數(shù) mg/kg

2.3 有效成分與礦質(zhì)元素的相關(guān)性

本研究對8種有效成分與28種礦質(zhì)元素這2組變量進行相關(guān)性分析，以Pearson系數(shù)及P值作為標(biāo)準(zhǔn)判斷這2組變量間的相關(guān)性（表3）。結(jié)果表明，款冬酮的含量與N（0.751）、P（0.686）的含量呈顯著相關(guān)，與K（0.874）的含量呈極顯著相關(guān)，與 Ca(-0.762)、Ti(-0.666)、V(-0.635)、Co(-0.654)、Sr(-0.678)、Ba(-0.701)、Pb(-0.663)的含量呈顯著相關(guān)，與U(-0.810)的含量呈極顯著相關(guān)；蘆丁的含量與N（0.693）、K（0.727）、Rb（0.690）的含量呈顯著相關(guān)；新綠原酸含量與Li(-0.842)、B(-0.773)的含量呈極顯著相關(guān)；綠原酸與Li(-0.802)的含量呈顯著相關(guān)；異綠原酸A含量與Li(-0.741)的含量以及異綠原酸C與Li(-0.688)的含量均呈顯著相關(guān)。

表3 款冬花有效成分與無機元素的Pearson相關(guān)系數(shù)分析

3 討論

本研究測定了臨夏10個不同產(chǎn)地的款冬花樣品中的8種有效成分及28種礦質(zhì)元素的含量，并進行了雙變量相關(guān)性分析，其結(jié)果對于了解礦質(zhì)元素對款冬花有效成分產(chǎn)生的影響，以及對生產(chǎn)過程中對有益礦質(zhì)元素的富集、重金屬及有害元素的防避提供了科學(xué)依據(jù)，對款冬花藥材的田間施肥、品質(zhì)提高及安全使用均具有指導(dǎo)意義。

2020年版《中國藥典》沿襲了2015年版一部款冬花項的規(guī)定，含有量指標(biāo)僅檢測款冬酮1種成分，有學(xué)者指出這不能全面反映款冬花的質(zhì)量［3-4］。在本研究中，總綠原酸類成分在10個樣品中的含量的均值為43.25 mg/g，是含量較高的主要成分，其藥理與款冬花的主要用途具有一致性［10-11］。從統(tǒng)計分析結(jié)果看，款冬酮的含量與蘆丁的含量呈極顯著相關(guān)，在樣品中較為一致；而對于綠原酸類成分而言，盡管款冬酮的含量與綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的含量呈顯著相關(guān)，并不能排除迥異個體的出現(xiàn)：HZ3樣品中的款冬酮含量達標(biāo)，但其新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的含量在所有樣品中均為最低，且低于款冬酮未達標(biāo)的HZ2、JSS1樣品?？疃ㄖ饕行С煞趾颗c款冬酮含量不一致的情況，表明除款冬酮外，有必要增加其他成分如綠原酸類為分析檢測性指標(biāo)。綠原酸類成分與款冬酮含量的分異緣于其在合成中分屬不同的代謝路徑，光照、水分、溫度、土壤等環(huán)境因子的差異均可導(dǎo)致其含量的變化，綠原酸類成分的合成對光照更敏感［12］。

礦質(zhì)元素是藥材質(zhì)量評價的指標(biāo)，同時也是影響藥材有效成分的主要因子。HZ1樣品中的款冬酮、綠原酸、異綠原酸A和蘆丁在所有樣品中的含量最高，其對應(yīng)的主量礦質(zhì)元素中N、P、K的含量也最高，而Ca、Al的含量較低；HZ2樣品中有效成分的含量相對較低，其對應(yīng)的主要礦質(zhì)元素中N、P、K的含量最低，而Ca的含量最高，Al的含量為次高；從雙變量相關(guān)性分析來看，款冬酮的含量與N、P的含量呈顯著正相關(guān)，與K的含量呈極顯著正相關(guān)，與Ca的含量呈顯著負相關(guān)；蘆丁的含量與N、K的含量呈顯著正相關(guān)，與P的含量呈正相關(guān)，與Ca、Al的含量呈負相關(guān)。結(jié)合測試結(jié)果分析，臨夏州的款冬花在種植過程中應(yīng)增施N、P、K肥，同時應(yīng)避開Ca、Al含量高的土壤。