周科 向杰 張長(zhǎng)江 張莉

[摘要]?目的?篩選心房顫動(dòng)（atrial?fibrillation，AF）促纖維化的關(guān)鍵基因及信號(hào)通路，探討AF誘導(dǎo)的人心房成纖維細(xì)胞的促纖維化重塑的分子機(jī)制。方法?從公共基因數(shù)據(jù)庫(kù)（gene?expression?omnibus，GEO）下載單細(xì)胞RNA序列表達(dá)譜GSE148506，通過(guò)主成分分析和T分布式隨機(jī)鄰接嵌入得到差異基因，利用SingleR軟件包進(jìn)行細(xì)胞類型注釋和軌跡分析，使用clusterprofiler軟件包，對(duì)成纖維細(xì)胞的差異基因進(jìn)行基因本體（gene?ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genome，KEGG）信號(hào)通路分析。利用在線STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和模塊分析。利用插件cytoHubba篩選出關(guān)鍵基因。結(jié)果?共得到6個(gè)細(xì)胞類型注釋群，包括成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞。共鑒定出367個(gè)成纖維細(xì)胞差異基因，包括37個(gè)下調(diào)基因和330個(gè)上調(diào)基因。GO功能富集分析結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞的差異基因生物過(guò)程主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)組織等；細(xì)胞組成主要富集于含膠原細(xì)胞外基質(zhì)等；分子功能主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分等。KEGG信號(hào)通路分析表明，差異基因主要富集于黏著斑、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用等。STRING分析從蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作圖中鑒定出6個(gè)成纖維細(xì)胞關(guān)鍵基因，即FN1、TIMP1、LAMB1、FBN1、C3、VCAN。結(jié)論?利用生物信息學(xué)分析，鑒定出FN1、TIMP1、LAMB1、FBN1、C3、VCAN在內(nèi)的基因及黏著斑、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白酶信號(hào)通路和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路可能是AF誘導(dǎo)的人心房成纖維細(xì)胞促纖維化重塑的重要分子機(jī)制。

[關(guān)鍵詞]?心房顫動(dòng)；單細(xì)胞RNA序列；人心房成纖維細(xì)胞；生物信息學(xué)分析

[中圖分類號(hào)]?R541.7??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.09.001

Bioinformatics?analysis?of?single-cell?RNA-seq?of?atrial?human?fibroblasts?with?atrial?fibrillation

ZHOU?Ke，?XIANG?Jie，?ZHANG?Changjiang，?ZHANG?Li

Cardiology?Department，?Affiliated?Minda?Hospital?of?Hubei?Minzu?University，?Enshi?445000，?Hubei，?China

[Abstract]?Objective?To?screen?key?genes?and?signaling?pathways?for?pro-fibrosis?in?atrial?fibrillation?（AF）?and?explore?the?molecular?mechanisms?of?AF-induced?pro-fibrotic?remodeling?in?human?atrial?fibroblasts.?Methods?Single-cell?RNA-seq?（scRNA-seq）?expression?profile?GSE148506?（AF?and?SR?fibroblasts），?was?downloaded?from?the?gene?expression?omnibus?（GEO）?database.?The?marker?genes?were?obtained?by?quality?control?and?data?filtering，?principal?component?analysis?and?t-distributed?stochastic?neighbor?embedding.?SingleR?package?was?utilized?for?cell?type?annotation?and?trajectory?analysis.?By?using?the?clusterprofiler?package，?the?marker?genes?of?fibroblasts?were?performed?through?gene?ontology?（GO）?and?Kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genomes?（KEGG）?pathway?analysis.?Protein-protein?interaction?network?analysis?and?module?analysis?was?performed?using?the?STRING?database?and?Cytoscape?software.?The?hub?genes?were?screened?out?by?utilizing?the?plug-in?cytoHubba.?Results?6?clusters?of?cell?type?annotations?were?obtained，?included?fibroblasts，?adipocytes，?endothelialcells，?monocytes，?fibroblasts，?skeletal?muscle.?A?total?of?367?fibroblasts?marker?genes?were?identified，?included?37?down-regulated?and?330?up-regulated?genes.?GO?functional?enrichment?analysis?results?showed?that?the?marker?genes?for?fibroblasts?were?predominantly?enriched?for?extracellular?matrix?organization?for?biological?process;?collagen-containing?extracellular?matrix?for?cellular?component;?and?extracellular?matrix?structural?constituent?for?molecular?function.?KEGG?pathway?analyses?indicated?that?the?marker?genes?were?meaningfully?enriched?in?Focal?adhesion，?extracellular?matrix?（ECM）-receptor?interaction，?and?so?on.?Top?6?hub?genes?of?fibroblasts?included?FN1，?TIMP1，?LAMB1，?FBN1，?C3，?VCAN.?Conclusion?Using?bioinformatics?analysis，?we?identified?genes?including?FN1，?TIMP1，?LAMB1，?FBN1，?C3?and?VCAN?and?Focal?adhesion，?ECM-receptor?interactions，?PI3K-AKT?signaling?pathway?and?transforming?growth?factor-β?signaling?pathway?as?possible?important?molecular?mechanisms?of?pro-fibrotic?remodeling?in?human?atrial?fibroblasts?in?AF.

[Key?words]?Atrial?fibrillation;?Single-cell?RNA-seq;?Atrial?human?fibroblasts;?Bioinformatics?analysis

心房顫動(dòng)（atrial?fibrillation，AF）是臨床上常見(jiàn)的心律失常類型之一，其發(fā)病率的增加與許多因素有關(guān)，如高血壓、糖尿病、肥胖、吸煙等，導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)和組織病理學(xué)的改變，從而增加對(duì)AF的易感性[1]。目前觀點(diǎn)認(rèn)為，心房纖維化會(huì)刺激心房結(jié)構(gòu)的重塑，從而導(dǎo)致AF的發(fā)生和維持[2]。研究表明，AF患者纖維組織的含量和分布與AF發(fā)生的機(jī)制、并發(fā)癥和治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[3]。成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是心肌中豐富的非肌細(xì)胞群，它控制著細(xì)胞外基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)[4]。成纖維細(xì)胞占心臟細(xì)胞數(shù)量的75%，但僅占其質(zhì)量的10%～15%[5]。因此，通過(guò)成纖維細(xì)胞可更好地了解AF發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制并發(fā)現(xiàn)抗心律失常干預(yù)的新靶點(diǎn)。單細(xì)胞RNA測(cè)序（single-cell?RNA-seq，scRNA-seq）可在細(xì)胞分子水平上全面分析AF的發(fā)生機(jī)制，AF的遺傳學(xué)非常復(fù)雜，罕見(jiàn)和常見(jiàn)的突變均會(huì)增加對(duì)AF的易感性[6]。盡管許多研究已通過(guò)微陣列分析獲得與AF相關(guān)的潛在基因和通路，但目前對(duì)AF患者成纖維細(xì)胞scRNA-seq的研究較少。本研究通過(guò)成纖維細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)分析，利用AF和竇性心律（sinus?rhythm，SR）樣本的成纖維細(xì)胞以評(píng)估AF中的差異基因和潛在信號(hào)通路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1??材料與方法

1.1??scRNA-seq數(shù)據(jù)

篩選公共基因數(shù)據(jù)庫(kù)（gene?expression?omnibus，geo）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中所有AF成纖維細(xì)胞的scRNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)集后，選擇GSE148506進(jìn)行分析，它來(lái)自GPL18573平臺(tái)Illumina?NextSeq?500（Homo?sapiens），包括4個(gè)AF和4個(gè)SR的384個(gè)樣本的表達(dá)譜。

1.2??PCA和T-SNE分析

主成分分析（principal?component?analysis，PCA）和T分布式隨機(jī)鄰接嵌入（t-distributed?stochastic?neighbor?embedding，T-SNE）被用于數(shù)據(jù)的降維處理。由于原理和機(jī)制不同，T-SNE保留的屬性信息更具代表性，反映樣本間差異，但T-SNE速度較慢，PCA速度相對(duì)較快。

1.3??差異基因

經(jīng)T-SNE分析后得到不同聚類，將|log?（fold?change）|>2和P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)尋找每個(gè)聚類的差異基因。

1.4??細(xì)胞類型注釋和軌跡分析

SingleR是一種計(jì)算方法，將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與參考轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集相關(guān)聯(lián)，并迭代改進(jìn)其推斷，可用于改進(jìn)scRNA-seq中的細(xì)胞類型注釋。Monocle工具被用于分析細(xì)胞分化軌跡，以轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，使用模型預(yù)測(cè)細(xì)胞進(jìn)化/分化過(guò)程。

1.5??GO和KEGG通路富集分析

使用R軟件包Clusterprofler比較基因簇之間的生物學(xué)特性，利用其進(jìn)行基因本體（gene?ontology，?GO）分析探討差異基因的生物學(xué)功能，并進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genomes，KEGG）通路分析以確定差異基因富集的信號(hào)通路。

1.6??蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

使用在線STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）預(yù)測(cè)差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)信息，相互作用論證的最高置信度設(shè)定>0.7。利用Cytoscape（3.7.1版）軟件對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析。通過(guò)使用cytoHubba插件最大克里爾中心度和度識(shí)別關(guān)鍵基因，包括利用Cytoscape軟件的分子復(fù)合體檢測(cè)（molecular?complex?detection，MCODE）插件尋找整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的模塊，參數(shù)設(shè)置：度值=2，節(jié)點(diǎn)得分值=0.2，k-core=2，最大深度=100。

2??結(jié)果

2.1??PCA和T-SNE分析

經(jīng)PCA分析得到一系列主成分（principal?component，PC），見(jiàn)圖1。實(shí)際PC關(guān)鍵基因與理論基因的差異顯示見(jiàn)圖2。選擇前20個(gè)PC進(jìn)行T-SNE分析，得到6個(gè)聚類。不同細(xì)胞群中基因的表達(dá)情況見(jiàn)圖3。各聚類中6個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)水平的小提琴圖見(jiàn)圖4A；T-SNE中6個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)水平的散點(diǎn)圖見(jiàn)圖4B；各聚類中6個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)水平的氣泡圖見(jiàn)圖4C。關(guān)鍵基因的表達(dá)主要集中在聚類0和4，選擇聚類0和4（成纖維細(xì)胞群）的差異基因進(jìn)行分析。

2.2??細(xì)胞類型注釋和軌跡分析

共得到6個(gè)聚類的細(xì)胞類型。聚類0，成纖維細(xì)胞；聚類1，脂肪細(xì)胞；聚類2，內(nèi)皮細(xì)胞；聚類3，單核細(xì)胞；聚類4，成纖維細(xì)胞；聚類5，骨骼肌細(xì)胞。6個(gè)聚類細(xì)胞類型的軌跡分析見(jiàn)圖5。

2.3??差異基因

聚類0中共鑒定出242個(gè)標(biāo)記基因，包括205個(gè)上調(diào)的差異基因和37個(gè)下調(diào)的差異基因；聚類4中共鑒定出125個(gè)上調(diào)的差異基因，聚類4中未篩選出下調(diào)的差異基因。

2.4??GO和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞的差異基因生物過(guò)程主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、結(jié)締組織；細(xì)胞組成主要富集于含膠原細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔；分子功能主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、糖胺聚糖結(jié)合、肝素結(jié)合。GO富集度前5位的基因及其相關(guān)基因見(jiàn)圖6A、6B。KEGG信號(hào)通路分析表明，差異基因主要富集于黏著斑、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、血管平滑肌收縮、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide?3-kinases，PI3K）-蛋白激酶B（protein?kinase?B，AKT）信號(hào)通路（PI3K-AKT）、蛋白質(zhì)消化吸收等，前5個(gè)KEGG信號(hào)通路及其相關(guān)基因見(jiàn)圖6C、6D。

2.5??蛋白互作網(wǎng)絡(luò)、關(guān)鍵基因和模塊分析

使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，創(chuàng)建一個(gè)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)探討這些差異基因的生物學(xué)特性，包含343個(gè)節(jié)點(diǎn)和786條邊。使用Cytoscape-cytoHubba插件，通過(guò)最大克里爾中心度和度值的方法篩選出6個(gè)關(guān)鍵基因，即FN1、TIMP1、LAMB1、FBN1、C3和VCAN。

3??討論

AF是一種日趨嚴(yán)重的臨床疾病，遺傳學(xué)特征復(fù)雜，罕見(jiàn)和常見(jiàn)的基因突變均可極大地增加AF的易感性。近年來(lái)生物信息學(xué)取得較大進(jìn)步，隨著基因芯片技術(shù)的快速發(fā)展，基因芯片技術(shù)在心血管臨床和研究中得到廣泛應(yīng)用。因此，應(yīng)用生物信息學(xué)方法進(jìn)一步探討AF的發(fā)病機(jī)制非常重要，有助于在遺傳水平上發(fā)現(xiàn)預(yù)防和治療AF的新靶點(diǎn)。本研究中，被鑒定出的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路在AF的研究中已有少量報(bào)道，表明綜合生物信息學(xué)分析的結(jié)果具有重要作用。

結(jié)構(gòu)重塑、電重塑和收縮性重塑在AF的發(fā)展和維持中起著關(guān)鍵作用。結(jié)構(gòu)重塑取決于兩個(gè)部分：一是細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，二是細(xì)胞外基質(zhì)分布不平衡[7-8]。大量研究表明，AF的存在與細(xì)胞外基質(zhì)沉積和降解平衡關(guān)系的破壞與心房重塑之間存在著極大的相關(guān)性[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，這些差異基因主要富集在與細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)的生物過(guò)程中。心肌成纖維細(xì)胞主要參與心肌重塑，單核細(xì)胞在心肌梗死誘發(fā)的炎癥期間的心臟重塑中也發(fā)揮重要作用[9]。此外，在炎癥和傷口愈合期間，誘發(fā)的心臟纖維化與單核細(xì)胞亞群有關(guān)，這些證據(jù)表明，單核細(xì)胞與AF密切相關(guān)[10]。根據(jù)細(xì)胞軌跡分析結(jié)果顯示，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞相互毗鄰。金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue?inhibitor?of?metalloproteinases-1，TIMP-1）基因通過(guò)控制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix?metalloproteinases，MMPs）的活性在細(xì)胞外基質(zhì)重塑中發(fā)揮重要作用。研究表明，血漿和組織中TIMP-1水平的升高與心肌纖維化和舒張功能障礙有著密切的聯(lián)系[11]。同時(shí)，TIMP-1對(duì)AF的病理生理學(xué)有重大影響，而這種影響是由MMPs和TIMPs間的不平衡所致[12]。Nakano等[13]發(fā)現(xiàn)MMP-9在AF患者的心房組織中高度表達(dá)，可能導(dǎo)致AF期間心房結(jié)構(gòu)重塑和心房擴(kuò)張，因此，本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，TIMP-1/MMPs信號(hào)通路是治療AF心房重塑和纖維化的潛在目標(biāo)。

纖連蛋白1（fibronectin?1，F(xiàn)N1）屬于細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白家族，廣泛存在于各種類型的細(xì)胞中，與細(xì)胞的黏附和遷移過(guò)程密切相關(guān)，通過(guò)整合素跨膜受體參與病理生理過(guò)程變化[14-15]。Dong等[16]發(fā)現(xiàn)在心肌纖維化重塑和衰竭過(guò)程中，成纖維細(xì)胞的FN1表達(dá)顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N1主要富集在黏著斑、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用和PI3K-AKT信號(hào)通路上，F(xiàn)N1通過(guò)影響PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)特性，通過(guò)阻斷PI3K-AKT的激活抑制FN1基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞衰老和凋亡，并減少細(xì)胞遷移和侵襲[17]。

通過(guò)KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白-1（fibrillin-1，F(xiàn)BN-1）明顯富集于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming?growth?factor-β，TGF-β）信號(hào)通路中。TGF-β被認(rèn)為是心房纖維化的一個(gè)主要介質(zhì)，而TGF-β過(guò)度表達(dá)模型在體外或體內(nèi)研究心房纖維化和AF的發(fā)病機(jī)制已被廣泛認(rèn)可[18-19]。

總之，利用AF和SR患者成纖維細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)，確定與AF相關(guān)的差異表達(dá)基因，從而在基因水平上探討AF發(fā)生的機(jī)制。FN1、TIMP1、LAMB1、FBN1、C3和VCAN在內(nèi)的基因及黏著斑、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、PI3K-AKT信號(hào)通路和TGF-β信號(hào)通路有可能成為AF的新生標(biāo)志物，并可能成為AF的潛在治療目標(biāo)。

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