李 丹，馬麗娜，施 安，王 燕，侯鵬霞，梁小軍*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西西安 712100；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002）

Booroola (FecB）基因是在綿羊中鑒定出的第一個(gè)高繁殖力主效基因[1]，其遺傳效應(yīng)是增加排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)[2]。目前，F(xiàn)ecB 突變作為高產(chǎn)羔數(shù)的分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于綿羊育種改良中。湖羊繁殖力高、性成熟早且含有FecB 基因；而寧夏灘羊雖然肉質(zhì)鮮美，但產(chǎn)羔率低[3-4]。為提高灘羊繁殖率，同時(shí)發(fā)揮湖羊多胎高產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)灘羊公羊和湖羊母羊進(jìn)行雜交生產(chǎn)灘湖雜羊，通過(guò)橫交固定得到灘湖雜羊群體G0、G1、G2代。本研究應(yīng)用TaqMan 探針技術(shù)，對(duì)灘湖雜交羊G0，G1，G2代血液樣本中的FecB 基因進(jìn)行分析，將傳統(tǒng)的常規(guī)表型選擇育種方法與FecB 基因分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)相結(jié)合，旨在加快灘羊多胎品種(系）的選育步伐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選配方法：試驗(yàn)羊來(lái)自同心榮華養(yǎng)殖場(chǎng)，灘羊公羊與湖羊母羊雜交產(chǎn)灘湖F1代，灘湖F1代母羊與灘羊公羊雜交產(chǎn)灘湖F2代，灘湖F2代母羊與灘湖F2代公羊橫交固定產(chǎn)灘湖橫交固定一世代(G0代），進(jìn)一步繁殖產(chǎn)灘湖橫交固定二世代(G1代）、灘湖橫交固定三世代(G2代）。

2022 年6 月，選取核心群橫交固定三個(gè)世代的灘湖雜交羊共計(jì)242 只作為試驗(yàn)動(dòng)物，其中G0代78 只，G1代142 只，G2代22 只。

1.2 血樣采集

每只羊頸靜脈采血5mL，保存于EDTA 抗凝管中，采血后顛倒混勻以防止血液凝固，于-20℃冷凍保存。

1.3 DNA 提取與純度檢測(cè)

使用天根全血基因組DNA 提取試劑盒(DP318）提取，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，使用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)對(duì)得到的DNA 片段的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 引物及探針序列

利用Taqman 探針檢測(cè)FecB 基因多態(tài)性的方法 (CN105176982A）進(jìn)行FecB 檢測(cè)分型 (表1）。BB 型代表FecB 基因CDS 區(qū)第746 位堿基發(fā)生A 至G 的突變(g.A746G），導(dǎo)致FecB 蛋白第249 的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼?p.Q249R），++型代表FecB 基因的CDS 區(qū)第746 位堿基未發(fā)生改變，仍為A。

表1 引物與探名序列

1.5 RT-PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序

RT-PCR 反應(yīng)體系為6μL：基因組DNA 1μL，2×Master Mix 3μL，10μmol/L 正向、反向引物各0.3μL；10μmol/L 探針P-G 和P-A 各0.15μL，去離子水補(bǔ)齊至6μL。

RT-PCR 反應(yīng)程 序：95℃ 10min，95℃30s，60℃60s，40 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果分析

2.1 DNA 提取及檢測(cè)

本試驗(yàn)中提取的血液基因組DNA 的OD 值為1.7～1.9，并經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠110V 電泳20min 可見(jiàn)各泳道都有一條清晰的帶(圖1），說(shuō)明基因組DNA 質(zhì)量良好、無(wú)降解也無(wú)RNA 污染，可直接用于后續(xù)探針?lè)中汀?/p>

圖1 DNA 瓊脂糖凝膠電泳

2.2 灘湖雜羊FecB 基因TaqMan 探針?lè)中徒Y(jié)果

由圖2 可見(jiàn)，F(xiàn)ecB 基因TaqMan 探針?lè)中惋@示FecB 基因在灘羊群體中具有3 種基因型，分別為BB、B+、++。

圖2 FecB 基因基因分型散點(diǎn)圖

2.3 灘湖雜羊FecB 基因基因型結(jié)果

由表2 可知，G0代、G1代、G2代的FecB 基因的等位基因頻率與基因型頻率，G0代群體中BB、B+、++基因型頻率分別為2.56%、14.10%和83.33%，B、+等位基因頻率分別為9.62%、90.38%。G1代群體中BB、B+、++基因型頻率分別為28，17%、38.73%和33.10%，B、+等位基因頻率為47.54%和52.46%。G2代群體中BB、B+、++基因型頻率分別為18.18%、54.54%和27.27%，B、+等位基因頻率分別為45.45%、54.54%。

表2 不同橫交固定世代FecB 基因分布情況

3 討論

劉秋月等[5]建立的檢測(cè)FecB 突變的TaqMan探針?lè)?，是一種通過(guò)檢測(cè)PCR 過(guò)程中及結(jié)束后產(chǎn)生的熒光信號(hào)來(lái)區(qū)分等位基因類型的SNP 檢測(cè)技術(shù)[6]。該方法可進(jìn)行大批量的高效檢測(cè)，也是近年來(lái)廣泛應(yīng)用于綿羊FecB 突變的檢測(cè)技術(shù)。Zhou 等[7]利用TaqMan 探針?lè)z驗(yàn)FecB 突變，并統(tǒng)計(jì)分析了不同基因型群體的產(chǎn)羔率，發(fā)現(xiàn)FecB突變顯著影響綿羊的繁殖性能。馬麗娜等[8]認(rèn)為FecB 基因可以作為灘羊多胎性選育的分子遺傳標(biāo)記，并能有效提高灘羊個(gè)體平均產(chǎn)羔數(shù)，通過(guò)基因型選育，還可以加快灘羊高繁品系的建立。李君等[9]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ecB 基因在黃淮杜泊羊群體中存在BB、B+、++等3 種基因型，其中B+型(雜合型）是群體中的優(yōu)勢(shì)基因型，BB 和B+基因型產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于++基因型。郭立宏[10]利用SSCP 標(biāo)記對(duì)東北細(xì)毛羊FecB 基因進(jìn)行檢測(cè)，認(rèn)為FecB 基因是控制多羔性狀的主效基因，選擇BB 和B+基因型母羊留作種用，可以加快東北細(xì)毛肉羊多胎品系的育成速度。

本試驗(yàn)利用TaqMan 探針對(duì)242 只灘湖雜交后代FecB 基因進(jìn)行SNP 分型檢測(cè)，結(jié)果表明，灘湖雜交后代GO、G1、G2代中存在BB、B+、++3 種基因型。隨著橫交固定體系的持續(xù)開(kāi)展，B+基因型頻率依次升高，++基因型頻率依次降低，而BB 基因型理論上與B+型的規(guī)律應(yīng)一致保持協(xié)同增長(zhǎng)趨勢(shì)，但G2代的BB 型低于G1代次，可能是此次試驗(yàn)抽取的G2群體數(shù)量太少，樣本沒(méi)有代表性容易被偏差個(gè)體影響整體試驗(yàn)結(jié)果，影響了BB 基因型在G2代群體中的分布頻率。因此還需進(jìn)一步擴(kuò)充G2代樣本量為品系選育選配提供穩(wěn)定的FecB 突變背景和遺傳材料。隨著橫交固定階段的延伸，等位基因頻率B、+等位基因變化規(guī)律與基因型頻率類似。

羅生金[11]將湖羊的FecB 基因?qū)牍_克羊群體中，用湖哈F1代公母羊(基因型均為B+）橫交，產(chǎn)羔率達(dá)到172%，湖哈F1代公羊(基因型為B+）與湖哈F1代母羊(基因型為BB）橫交，產(chǎn)羔率達(dá)到200%，而湖哈F1代公羊(基因型為B+）與湖哈F1代母羊(基因型為++）橫交，產(chǎn)羔率為109%。李彬等[12]在灘羊群體中導(dǎo)入小尾寒羊的FecB 基因，古麗格娜等[13]在吐魯番黑羊群體中導(dǎo)入策勒黑羊的FecB 基因，均增加了后代的產(chǎn)羔率。

這些成功的實(shí)例證明，在繁殖力較低的群體中導(dǎo)入FecB 基因，能有效地提高綿羊群體的繁殖力。

4 結(jié)論

本研究在灘羊群體中導(dǎo)入湖羊的FecB 基因，并采用基因檢測(cè)技術(shù)選留含有B 基因的個(gè)體，提高群體的B 基因頻率。因此，利用基因型選育技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)選種方法，通過(guò)選留含有B 基因的公母羊繁殖，可顯著改善灘羊FecB 基因的基因型結(jié)構(gòu)和基因頻率，提高群體的產(chǎn)羔數(shù)，加快灘羊高繁品種(系）的建立。