劉風(fēng)琴，李秀珍，李婷婷，郭樹靜

( 山東省德州市食品藥品檢驗檢測中心，山東 德州 253000)

板藍根顆粒是一種由大青葉和板藍根兩種中藥材共同組成的中藥制劑，主要具有解毒、清熱、涼血、利咽等各種功效，臨床中主要應(yīng)用于流行性腮腺炎、流行性感冒發(fā)熱等病毒性疾病的預(yù)防和治療，同時也是治療病毒性肝炎的傳統(tǒng)藥物之一，針對扁平疣、帶狀皰疹等各種病毒性皮膚疾病也有較好的臨床療效[1]。大青葉具有涼血消斑、清熱解毒的功效，主要應(yīng)用于抑菌、抗病毒、抗腫瘤、增強機體免疫力和抗炎治療中。板藍根則具有涼血利咽、清熱解毒，以及抗病毒、抗菌、增強免疫功能、抗內(nèi)毒素、抗血小板聚集、抗癌等各種功效。中成藥制劑在生產(chǎn)過程中，需要經(jīng)歷多個環(huán)節(jié)，這就使得它們極易被微生物污染，從而使得其安全性和質(zhì)量受到影響。加強藥品的微生物檢驗和限度測定是保證藥品安全性的重要措施[2]。需氧菌總數(shù)是2020年版《中國藥典》中針對非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查的重要項目，同時也是評價藥品安全性的重要指標(biāo)，其能夠較好地反映出藥品在生產(chǎn)期間是否達到了生產(chǎn)要求。微生物計數(shù)法主要包括了薄膜過濾法、平皿法、最可能數(shù)法，平皿法是微生物計數(shù)方法中應(yīng)用范圍最廣的試驗方法[3]。本研究根據(jù)《中華人民共和國藥典》中關(guān)于控制菌檢查法和微生物計數(shù)法的相關(guān)指導(dǎo)，構(gòu)建起板藍根顆粒的需氧菌總數(shù)限定檢測方法，期望為板藍根顆粒的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

MLS—378L—PC 高壓蒸汽滅菌器（松下健康醫(yī)療器械株式會社）；XS105DU 電子天平〔梅特勒一托利多( 上海) 有限公司〕；SHP—250 生化培養(yǎng)箱( 上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；BWS—27 精密恒溫水槽( 上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；HR40-IIA2 生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司)；IKA 渦旋混勻器(德國)。

1.2 試驗試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（北京路橋技術(shù)股份有限公司）；pH 7.0 無菌氯化鈉·蛋白胨緩沖液（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；滅菌生理鹽水。大腸埃希菌定量菌株（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；板藍根顆粒樣品（編號為QA01、QA02、QA03，中國食品藥品檢定研究院提供）。

1.3 試驗方法

根據(jù)《中國藥典》2020 年版第四部通則1105 中的平皿法進行樣品需氧菌總數(shù)的檢測操作。

1.3.1 樣品前處理 首先取樣品放置于室溫環(huán)境下，運用75% 乙醇對瓶身進行擦拭，然后在生物安全柜內(nèi)小心地將西林瓶蓋開啟。取10 mL 滅菌用水加入瓶內(nèi)，將瓶蓋蓋好。充分溶解混合后的樣品，即可作為待測供試品。在室溫下放置15 min 后可進行測試。按照相同的方法獲得3 份樣品。

1.3.2 樣品稀釋 運用稀釋管精準抽取上述待測樣品5 mL，轉(zhuǎn)移至pH 7.0 的無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液（45 mL）中，對其進行充分的振搖。混合均勻，即得1:10 的樣品。抽取1 mL 的溶液加入pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（9 mL）中，混合均勻即得1:100的樣品。按照上述稀釋制備方法繼續(xù)進行樣品稀釋，直至獲得1:100 000 的稀釋品。最終獲得3 份樣品。

1.3.3 樣品培養(yǎng) 陰性對照：吸取1 mL pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液，將其轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿內(nèi)；樣品：從上述3 種稀釋度的樣品中分別抽取1 mL 轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿中，平行兩份。在傾注培養(yǎng)基的過程中，溫度需要控制在45℃以內(nèi)，并以逆時針的方向?qū)ζ矫筮M行勻速旋轉(zhuǎn)。注意不得將培養(yǎng)基濺到皿蓋和皿邊上方，使其能夠充分的混勻，在其凝固之后，即可將平皿倒置于33℃的恒溫箱內(nèi)進行培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)3 ～5 d，注意觀察菌落數(shù)量。

1.3.4 計數(shù)與報告 根據(jù)《中國藥典》2020 年版中的相關(guān)要求，對平板上生長較佳的菌落進行計數(shù)識別，并如實記錄檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測結(jié)果

根據(jù)結(jié)果來看，相同稀釋度兩個平板的菌落數(shù)結(jié)果非常接近，這就表明試驗具有較好的平行性，同時結(jié)果準確度較高。陰性對照試驗無菌落生長，即表明試驗操作中未出現(xiàn)被污染的情況，結(jié)果有效。從QA01 樣品中選取1:1000 稀釋度來實施檢測，結(jié)果顯示為37 000 cfu/mL。針對QA02 樣品選取1:10 與1:100稀釋度進行檢測，結(jié)果顯示為1500 cfu/mL。而QA03的樣品無菌落生長。見表1。

表1 樣品檢測結(jié)果（cfu/mL）

2.2 能力驗證結(jié)果

根據(jù)中國食品藥品檢定研究院能力驗證結(jié)果來進行滿意度評價，即以≤2表示滿意，2＜≤3表示可疑，＞3表示不滿意。若三個樣品結(jié)果均表示為滿意，最終結(jié)果即可判定為“滿意”，若其中一個存疑或不滿意，即判定為“存疑”或者“不滿意”。根據(jù)表2 來看，本次測定結(jié)果表示為滿意，盡管QA03 中的指定值＜1，但本次測試結(jié)果為＜10 cfu/mL，即表明結(jié)果滿意。但為了能夠提升樣品的檢出限，此后針對未知樣品實施需氧菌總數(shù)計數(shù)檢驗期間，可以針對供試品原液實施計算。

表2 能力驗證評價表

3 結(jié)論

3.1 板藍根顆粒需氧菌總數(shù)計數(shù)

為了充分了解板藍根顆粒的需氧菌總數(shù)計數(shù)情況，本次測試采取平皿法微生物計數(shù)法按照《中國藥典》中相關(guān)要求進行了實驗操作，根據(jù)結(jié)果反饋情況來看，本次實驗?zāi)軌蛴行д莆瞻逅{根顆粒中的需氧菌總數(shù)計數(shù)情況。同時，在具備這種能力之后，也能夠更為客觀地評價實驗室技術(shù)能力與管理水平，還能夠?qū)⑵渥鳛橹匾曳浅Ｓ行У膶嶒炇彝獠抠|(zhì)量控制手段。

3.2 質(zhì)量控制分析

3.2.1 實驗前的準備控制 在接收到樣品之后，應(yīng)當(dāng)及時對樣品的完整性進行檢查，若樣品存在污染或者破損等問題，就必須及時聯(lián)系機構(gòu)做出處理。在接收到樣品之后必須盡快對其進行檢測。在進行實驗操作期間，所采用的各種吸管、培養(yǎng)基、鑷子等均必須根據(jù)相關(guān)要求來實施滅菌處理，同時及時驗證滅菌效果。為了避免因高壓滅菌導(dǎo)致培養(yǎng)基量和稀釋液的減少，或者為了能夠最大程度上控制傳遞中的污染問題，所有的稀釋液與培養(yǎng)基都需要配置相應(yīng)的硅膠塞，并做好獨立包扎吹。在對吸管實施滅菌處理之前，上端需要增加小段棉花，避免外界雜菌進入到管內(nèi)或者不慎將菌液抽吸出管外，引起不必要的污染問題[4]。

3.2.2 樣品制備和稀釋過程控制 在實驗操作之前首先需要將樣品放置到室溫條件下，運用75% 的乙醇充分擦拭瓶蓋，在安全柜內(nèi)完成無菌瓶相關(guān)操作，并向瓶內(nèi)緩慢加入滅菌水，在樣品充分混合之后再根據(jù)要求來進行后續(xù)操作。根據(jù)《中國藥典》中需氧菌總數(shù)的控制限度，對樣品進行稀釋處理，各個樣品需要配置兩個平板，這期間必須確保菌液具有較好的均勻性，同時在完成稀釋處理前后，均需要在混勻器上實施充分的混勻處理?；靹蚱陂g必須對力度進行嚴格控制，以防有飛濺引起污染。而根據(jù)本次結(jié)果來看，要更好地提升樣品的檢出限，可以采取原液來實施計數(shù)檢測[5]。

3.2.3 計數(shù)觀察控制 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在進行培養(yǎng)之后的2 d 內(nèi)就能夠?qū)嵤┯嫈?shù)觀察，以防菌落數(shù)覆蓋導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果受到影響。此后，分別需要再次對培養(yǎng)第3 d、4 d、5 d 的情況進行計數(shù)。需要注意的是，必須盡量保持在超凈工作臺內(nèi)計數(shù)，注意不得將培養(yǎng)皿的蓋子開啟，輕拿輕放，以免出現(xiàn)自身和交叉污染情況[6-7]。

總而言之，根據(jù)《中國藥典》中微生物限度檢查法對板藍根顆粒的需氧菌總數(shù)計數(shù)進行測定，較好地掌握了需氧菌數(shù)量情況，為板藍根顆粒的質(zhì)量控制提供了客觀指導(dǎo)。