綦國紅，楊志萍，王海翔，陳貴堂

中國藥科大學(xué)工學(xué)院（南京 211198）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一種革蘭陰性菌，在人的皮膚、呼吸道以及腸道均有分布，是醫(yī)院內(nèi)發(fā)生感染的主要條件致病菌之一[1]。由于該菌在環(huán)境中廣泛存在，也是污染食品導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的重要細菌之一[2]。PA通過釋放多種胞外毒性產(chǎn)物，如綠膿菌素、蛋白酶等引發(fā)宿主病變，并在感染者體內(nèi)產(chǎn)生含有脂多糖的生物膜，增強對宿主組織的黏附性，以及對治療過程中使用抗生素的抗性，導(dǎo)致PA引發(fā)的感染難以治療[1,3]。因此，研究如何抑制銅綠假單胞菌生物膜的表達具有重要意義。

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是一種細胞密度依賴的通信系統(tǒng)，由信號分子、信號分子合成酶和信號受體組成。當(dāng)信號分子合酶合成的信號分子達到閾值濃度時，信號分子與信號受體蛋白結(jié)合后啟動相應(yīng)基因的表達[4]。革蘭陰性菌最常見的群體感應(yīng)信號分子為N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯（AHL）[5]。研究發(fā)現(xiàn)PA毒性因子及生物膜的產(chǎn)生受AHL類信號分子介導(dǎo)的QS系統(tǒng)調(diào)控[4,6]。因此干擾PA菌QS系統(tǒng)必然會影響生物膜的形成及毒性因子的表達，為治療PA感染提供一種新途徑。

革蘭陰性菌中群體感應(yīng)干擾主要有3種途徑，最受關(guān)注的是：利用AHL分子的結(jié)構(gòu)類似物與受體蛋白結(jié)合，從而阻止AHL與受體蛋白結(jié)合，不能啟動相關(guān)性狀的表達[4,7]。因此有信號分子的類似物存在時，相關(guān)性狀的表達量下降。

白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種天然多酚化合物。在虎杖、葡萄皮和葡萄籽中含量較高，具有抗病毒、抗衰老、抗癌、調(diào)節(jié)血脂、免疫調(diào)節(jié)等多種重要的生物學(xué)活性，在醫(yī)療、食品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[8]。國內(nèi)外關(guān)于銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制的研究報道較多[2,9]，但關(guān)于RES對銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制方面的研究報道較少。試驗旨在利用群體感應(yīng)抑制的模式研究菌銅綠假單胞菌PAO1，研究RES是否可以作為群體感應(yīng)抑制劑，降低或減弱PAO1中由群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的性狀如生物膜、綠膿素等毒性因子的表達，以及RES是否可以提高PAO1對抗生素的敏感性，為RES的進一步應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料、試劑

紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CVO26（實驗室保藏），卡那霉素抗性，試驗使用的卡那霉素終濃度為20 μg/mL。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1（實驗室保藏）。

白藜蘆醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二甲亞砜（DMSO，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；三氯甲烷（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（南京化學(xué)試劑股份有限公司）；阿奇霉素（南京海辰藥業(yè)股份有限公司）；卡那霉素注射液（四川華蜀動物藥業(yè)有限公司）；N-己酰基高絲氨酸內(nèi)酯（N-hexanoyl-homoserine lactone，C6-HSL，Sigma-Aldrich）。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16G型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；UV-1800PC型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；EIx800TM酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；80i光學(xué)顯微鏡（尼康株式會社）。

1.3 方法

1.3.1 RES母液的配制

取0.100 g RES溶于10 mL 60% DMSO，得質(zhì)量濃度10 mg/mL的RES溶液，在-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 RES對CVO26最小抑菌濃度（MIC）的測定

根據(jù)文獻[7]，紫色桿菌CVO26活化2次后，按1%體積重新接種于LB培養(yǎng)基，并加入硫酸卡那霉素使其終質(zhì)量濃度為20 μg/mL，在28 ℃，以150 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液A600nm約0.3。按菌液與RES溶液體積比9︰1分裝至試管中，使RES終質(zhì)量濃度分別為40，60，80，100，120，140，160，180和200 μg/mL，過夜培養(yǎng)16~18 h，觀察各管中CVO26的生長情況，判斷最小抑菌濃度。

1.3.3 RES對CVO26紫色素產(chǎn)生的抑制作用

根據(jù)文獻[7]，按1.3.2方法獲得CVO26A600nm約0.3的菌液，按菌液與RES溶液的體積比9︰1分裝至50 mL錐形瓶，使RES最終質(zhì)量濃度分別為10，20，40和60 μg/mL，加入相應(yīng)體積的C6-HSL，使其終濃度為5 μmol/L，在28 ℃恒溫、以150 r/min振蕩培養(yǎng)16~18 h，觀察紫色素的產(chǎn)生。取3 mL CVO26培養(yǎng)液于離心管中，以13 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入3 mL DMSO，漩渦振蕩器混勻，以13 000 r/min離心10 min，上清液于580 nm測定吸光度。

1.3.4 RES對銅綠假單胞菌PAO1生長的影響

根據(jù)文獻[6]，PAO1活化2次后，按2%比例接種LB培養(yǎng)基，在37 ℃，以150 r/min振蕩培養(yǎng)至A600nm約0.3，菌液分裝50 mL錐形瓶后添加RES溶液，使RES終質(zhì)量濃度分別為20，60和80 μg/mL，對照組以無菌LB培養(yǎng)基代替RES溶液。在37 ℃，以150 r/min振蕩培養(yǎng)，并于0，2，4，6，8和10 h分別取200 μL培養(yǎng)液至96孔板中，酶標儀測菌液A630nm，繪制生長曲線。

1.3.5 RES對銅綠假單胞菌PAO1生物膜產(chǎn)生的抑制作用

根據(jù)文獻[6]，按1.3.4方法配制含有RES的活菌液，使RES終質(zhì)量濃度分別為40和60 μg/mL，內(nèi)置0.5 cm×0.5 cm的無菌處理的輸液管片，在37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)液，重新添加無菌LB培養(yǎng)基和RES，培養(yǎng)24 h。從培養(yǎng)液中取出輸液管片，洗凈表面的浮菌，在45 ℃干燥30 min，用0.2%結(jié)晶紫染色2 min，洗去多余結(jié)晶紫，在45 ℃干燥30 min，用95%乙醇洗脫3 min，移取200 μL洗脫液于96孔板中，用酶標儀于490 nm測定吸光度，并按式（1）計算抑制率。

式中：A0為對照組的吸光度；A1為試驗組的吸光度。

將結(jié)晶紫染色的輸液管片置于光學(xué)顯微鏡下，對輸液管片上生物膜的形態(tài)進行觀察，并拍照，具體方法參見文獻[6]。

1.3.6 RES對銅綠假單胞菌PAO1胞外多糖（EPS）產(chǎn)生的抑制作用

按1.3.4方法配制含有RES的活菌液，先在37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，再經(jīng)4 000 r/min離心20 min，取上清液，加入上清液3倍體積的冷乙醇，在4 ℃靜置24 h。經(jīng)12 000 r/min離心10 min，棄上清液。以沉淀2倍體積的蒸餾水對糖沉淀進行稀釋，采用苯酚-硫酸法測胞外多糖含量，并按式（1）計算抑制率[6]。

1.3.7 RES對銅綠假單胞菌PAO1綠膿素產(chǎn)生的抑制作用

按1.3.4方法配制含有RES活菌液，在37 ℃，以150 r/min振蕩培養(yǎng)16~18 h。取菌液，以4 000 r/min離心20 min，得上清液。每5 mL上清液，加入3 mL三氯甲烷萃取2 h。取下層三氯甲烷層并加入三氯甲烷層1/5體積0.2 mol/L的鹽酸，充分振蕩，離心，取上層鹽酸層，于520 nm處測定吸光度[1]。

1.3.8 RES與阿奇霉素協(xié)同對銅綠假單胞菌PAO1抑制作用

按1.3.4方法培養(yǎng)PAO1A600nm約0.3的菌液，并分裝于多孔板，試驗組1組加5 μg/mL阿奇霉素和40 μg/mL的RES，2組只加5 μg/mL阿奇霉素，3組只加40 μg/mL RES。對照組不加阿奇霉素，不加RES。于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，在酶標儀630 nm處測定吸光度[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RES對CVO26的最小抑菌濃度（MIC）

如表1所示，無菌生長的RES最低濃度為100 μg/mL，因此RES對CVO26的最小抑菌濃度為100 μg/mL。RES濃度40，60和80 μg/mL時，其對CVO26的生長無抑制作用。

表1 RES對CVO26的MIC

2.2 RES對CVO26產(chǎn)紫色素的抑制作用

由圖1可知，RES質(zhì)量濃度10和20 μg/mL時，CVO26的紫色與對照相比變化不明顯，RES質(zhì)量濃度40和60 μg/mL時，CVO26紫色明顯變淺。對CVO26產(chǎn)生的紫色素進行定量測定，結(jié)果如圖2所示。RES質(zhì)量濃度10和20 μg/mL時，A580nm與空白組相近，RES對紫色素的產(chǎn)生無抑制作用。但RES質(zhì)量濃度40 μg/mL時，A580nm明顯低于空白組，RES質(zhì)量濃度60 μg/mL時，其對CVO26紫色素產(chǎn)生的抑制率達97.89%，根據(jù)表1結(jié)果，RES質(zhì)量濃度40和60 μg/mL對CVO26的生長均無抑制作用，因此RES通過群體感應(yīng)抑制方式降低CVO26紫色素的產(chǎn)生量。

圖1 RES對CVO26紫色素產(chǎn)生的定性抑制作用

圖2 RES對CVO26產(chǎn)生紫色素的定量抑制作用

2.3 RES對銅綠假單胞菌PAO1生長的抑制作用

根據(jù)文獻[10]，RES對銅綠假單胞菌PAO1的MIC大于1 000 μg/mL，選取RES質(zhì)量濃度20，60和80 μg/mL，對PAO1生長曲線進行測定。由圖3可知，RES質(zhì)量濃度20，60和80 μg/mL時，試驗組與對照組的生長曲線基本一致，對PAO1生長無抑制作用。因此，后續(xù)試驗RES測定質(zhì)量濃度均為≤80 μg/mL。

圖3 RES對PAO1生長的抑制作用

2.4 RES對PAO1生物膜產(chǎn)生的抑制作用

由圖4可知，隨著RES濃度的增加，生物膜的抑制率隨之上升。RES質(zhì)量濃度40 μg/mL時生物膜的抑制率為13.0%；RES質(zhì)量濃度60 μg/mL時對生物膜的抑制率升高至26.2%。通過光學(xué)顯微鏡對輸液管片上的生物膜形態(tài)進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗組生物膜上的細胞密度與對照組相比明顯稀疏，且細胞團塊明顯變小，并且呈現(xiàn)濃度依賴的特性（圖5），與定量測定結(jié)果相一致。

圖4 RES對PAO1生物膜產(chǎn)生的定量抑制作用

圖5 RES對PAO1生物膜的定性抑制作用（400×）

2.5 RES對PAO1胞外多糖產(chǎn)生的抑制作用

多糖是細菌生物膜重要組成成分，影響生物膜產(chǎn)生的因素也會影響胞外多糖的產(chǎn)生[1]，因此對PAO1胞外多糖進行測定。由圖6可知，RES在40和60 μg/mL非抑菌質(zhì)量濃度條件下對PAO1胞外多糖的產(chǎn)生具有抑制作用，抑制率分別為34.8%和66.3%，且抑制率隨RES濃度的增加而增大。

圖6 RES對PAO1胞外多糖產(chǎn)生的抑制作用

2.6 RES對PAO1綠膿素產(chǎn)生的抑制作用

綠膿素是PAO1產(chǎn)生的一種重要的毒性物質(zhì)，由此測定RES對綠膿素產(chǎn)生量的影響。圖7表明，RES質(zhì)量濃度20，40和80 μg/mL時對綠膿素的產(chǎn)生均具有抑制作用，且綠膿素的產(chǎn)生量隨RES濃度的升高而降低。

圖7 RES對PAO1產(chǎn)綠膿素的抑制作用

2.7 RES與阿奇霉素協(xié)同對PAO1抑制作用

由于PAO1生長過程中分泌多種物質(zhì)，形成生物膜把自己包裹住，阻止抗生素擴散達到細胞，使之對抗生素的抗性增強。因此，試驗對白藜蘆醇與阿奇霉素的協(xié)同作用進行研究。由圖8可知，40 μg/mL RES與5 μg/mL阿奇霉素共同作用于PAO1時，與對照組相比生長抑制率為51%，而5 μg/mL阿奇霉素單獨作用于PAO1時生長抑制率為35%，前者明顯高于后者。由此可見，雖然40 μg/mL的RES對PAO1的生長不具有抑制作用，但與5 μg/mL阿奇霉素共同使用時，能夠增強阿奇霉素對PAO1的抑菌效果。

圖8 RES與阿奇霉素協(xié)同對PAO1的抑制作用

3 結(jié)論與討論

紫色桿菌CVO26是野生菌株ATCC 31532的mini-Tn5突變體，ATCC 31532紫色色素產(chǎn)生受C6-HSL介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控。CVO26不產(chǎn)C6-HSL，也不產(chǎn)紫色素，外源加入C6-HSL時，產(chǎn)生紫色素[7]。由于紫色素特征明顯，既可定性觀察也可定量測定。因此，CVO26常用作群體感應(yīng)抑制劑篩選的模式菌株。結(jié)果表明，RES作為C6-HSL的結(jié)構(gòu)類似物，對CVO26中QS調(diào)控性狀紫色素的產(chǎn)生具有明顯的抑制作用。

同樣，20~80 μg/mL的RES對PAO1生長均無抑制作用，但對PAO1中由QS系統(tǒng)調(diào)控性狀生物膜、胞外多糖、綠膿菌素等產(chǎn)生均有抑制作用。因此，RES不是因為抑制PAO1的生長降低細胞密度而導(dǎo)致生物膜、胞外多糖、綠膿菌素等產(chǎn)生量下降，而是作為群體感應(yīng)抑制劑與信號分子受體蛋白結(jié)合降低上述特性的表達量。

銅綠假單胞菌通過產(chǎn)生生物膜把自己包裹住，阻止抗菌物質(zhì)擴散到達靶標，致使療效減弱。而多糖是構(gòu)成生物膜的主要成分，因此胞外多糖也是導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生原因[2]。定性與定量相結(jié)合的方法研究RES對PAO1生物膜產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明，RES在對PAO1生長沒有選擇壓力的條件下，對生物膜的形成具有破壞作用，同時能夠降低胞外多糖的產(chǎn)生量。阿奇霉素是一種治療銅綠假單胞菌感染的抗菌藥物，研究結(jié)果顯示，40 μg/mL非抑菌質(zhì)量濃度的RES，與阿奇霉素共同作用時，PAO1對阿奇霉素的敏感性增強。根據(jù)文獻[11]分析，白藜蘆醇可以改變細胞膜的通透性，使抗生素更容易地穿過細胞膜，與生物膜的破壞作用相結(jié)合，使阿奇霉素更加有效發(fā)揮抑菌與殺菌作用。因此，在不改變阿奇霉素濃度的條件下，通過使用RES，增加PAO1對阿奇霉素的敏感性。推測RES與抗生素協(xié)同使用能恢復(fù)或增強抗生素對銅綠假單胞菌的有效性，進而能減少耐藥菌株的產(chǎn)生。