古敏晴 ，李楚潔 ，李飛飛 ，肖盼盼 ，王新文, ，李文保

1.深圳市華大海洋生物醫(yī)藥技術(shù)研究院（深圳 518000）；2.深圳華泓海洋生物醫(yī)藥有限公司（深圳 518000）；3.深圳華大海洋科技有限公司（深圳 518000）

酒精濫用和酒精依賴嚴(yán)重影響人類健康和生活。全球每年因酒精死亡的人數(shù)有330多萬人[1]。研究發(fā)現(xiàn)酒精能夠造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，從而導(dǎo)致神經(jīng)認(rèn)知障礙、學(xué)習(xí)和記憶損傷[2]。酒精引起的這些癥狀與神經(jīng)炎癥有關(guān)[3-4]，可能是通過Toll樣受體-4（TLR-4）激活小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)核因子kappa-κB（NF-κB）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）[5-6]。因此，通過開發(fā)一款具有抗神經(jīng)炎癥的安全有效的食源性功能產(chǎn)品，對患者進(jìn)行營養(yǎng)干預(yù)，以改善記憶，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

元寶楓為槭樹科的落葉喬木，元寶楓籽油的神經(jīng)酸含量在5%以上[7]，是一種新資源食品。神經(jīng)酸是一種促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長、再生和維持所需的高級營養(yǎng)物質(zhì)[8-9]。元寶楓籽油是神經(jīng)酸的主要商業(yè)來源[10]。二十二碳六烯酸（DHA）是在海產(chǎn)品，如深海魚油、藻油中發(fā)現(xiàn)的最重要的n-3 PUFA之一；DHA缺乏與中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)之間也存在聯(lián)系，如焦慮[11]、學(xué)習(xí)障礙[12]和認(rèn)知障礙[13]。酸棗仁提取物廣泛應(yīng)用于中藥，已被證明對治療失眠、睡眠問題、焦慮和神經(jīng)衰弱有效[14]。

試驗(yàn)以元寶楓籽油、DHA、酸棗仁提取物為原材料，利用體內(nèi)外試驗(yàn)研究三者不同配方對腦損傷和記憶障礙的改善作用，從而明確主要功效成分及最佳配方，并探究其潛在作用機(jī)理，為預(yù)防和治療酒精誘導(dǎo)的腦損傷和記憶障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

元寶楓籽油（西安百川生物科技有限公司）；DHA（廣州欣和健康科技有限公司）；酸棗仁提取物（南京郎澤生物科技有限公司）；玉米油（金龍魚牌）；競品1和競品2（購自京東）；乙醇（深圳市化試科技有限公司）；小鼠TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫分析試劑盒（北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司）；iba-1抗體（北京索萊寶科技有限公司）；異氟烷（江蘇恒豐強(qiáng)生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

水迷宮儀器（XR-XM101，上海欣軟信息科技有限公司）；全波長酶標(biāo)儀（Epoch+Elx508，美國伯騰儀器有限公司）；立式光學(xué)顯微鏡（DS-U3，尼康株式會社）；便攜式多道小動物麻醉機(jī)（ZS-MV-IV，北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）。

1.3 試驗(yàn)動物

ICR雄性小鼠136只（遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司）。SPF級動物房，每籠飼養(yǎng)小鼠4只，溫度24±2 ℃，濕度50%±10%，12 h光照-黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 主原料及原料配比篩選

1.4.1.1 主原料的提升記憶力效果

雄鼠適應(yīng)期結(jié)束后，按照體重隨機(jī)分為5組，分別是正常對照組、模型對照組、元寶楓籽油組、DHA組、酸棗仁提取物組。灌胃給藥3周后，開始制造記憶再現(xiàn)障礙模型：重測驗(yàn)前30 min灌胃30%的乙醇10 mL/（kg·bw）。使用水迷宮試驗(yàn)測試記憶能力。

1.4.1.2 不同配方的提升記憶力效果

雄鼠適應(yīng)期結(jié)束后，按照體重隨機(jī)分為7組，具體分組見表1。給藥3周后，開始制造記憶再現(xiàn)障礙模型：重測驗(yàn)前30 min灌胃30%的乙醇10 mL/（kg·bw）。使用水迷宮試驗(yàn)測試記憶能力。

表1 動物試驗(yàn)方案

1.4.1.3 最優(yōu)配方與競品的提升記憶力效果的對比

雄鼠適應(yīng)期結(jié)束后，按照體重隨機(jī)分為5組，分別是正常對照組、模型對照組、最優(yōu)配方組、競品1組、競品2組。灌胃給藥3周后，開始制造記憶再現(xiàn)障礙模型：重測驗(yàn)前30 min灌胃30%的乙醇10 mL/（kg·bw）。使用水迷宮試驗(yàn)測試記憶能力。

1.4.1.4 水迷宮檢測

方法參考文獻(xiàn)[15]。試驗(yàn)水迷宮為直徑120 cm、高度50 cm的圓柱形裝置，平臺為直徑12 cm的圓形平臺，水溫23~25 ℃，平臺在東北象限（NE），并低于水平面1 cm。每次將小鼠頭朝池壁放入水迷宮中，隨機(jī)放入不同位置。每次訓(xùn)練限定在60 s內(nèi)，若沒有超過60 s，記錄動物找到水下平臺的時(shí)間，為潛伏期；若超過60 s，時(shí)間則記錄為60 s。每只動物每天訓(xùn)練4次，兩次訓(xùn)練之間間隔30~40 min，共訓(xùn)練5 d。

1.4.2 最優(yōu)配方改善記憶的機(jī)制研究

1.4.2.1 腦切片蘇木精-伊紅（H-E）染色

試驗(yàn)第28天，異氟烷過量麻醉后犧牲小鼠，取全腦，用4%多聚甲醛固定至少24 h，并用石蠟包埋、切片（4 μm），用H-E染色。使用顯微鏡觀察腦切片，用CASEVIEWER全景掃描軟件拍照。

1.4.2.2 腦組織TNF-α和IL-β含量測定

使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測腦組織中TNF-α和IL-β的水平。所有的檢測均按照制造商的說明書進(jìn)行。

1.4.2.3 腦切片免疫熒光染色

iba-1是小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，其熒光強(qiáng)度可以顯示小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況。石蠟切片與小鼠iba-1抗體孵育。染色切片用顯微鏡觀察，并用CASEVIEWER全景掃描軟件拍照。

1.4.3 營養(yǎng)及質(zhì)量檢測

按照GB 17399——2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 糖果》、SB/T 10021——2017《糖果 凝膠糖果》及GB 2762——2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》的要求，對產(chǎn)品進(jìn)行營養(yǎng)及質(zhì)量檢測。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用雙尾t-檢驗(yàn)，其中P≤0.05表示差異性顯著。使用GraphPad Prism 7軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 主原料及原料配比篩選

2.1.1 主原料的提升記憶力效果

水迷宮檢測指標(biāo)中，潛伏期越短，則說明其記憶力越好。如圖1所示，與正常對照組比較，模型對照組小鼠第2~第5天學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練潛伏期顯著延長，而元寶楓籽油、DHA和酸棗仁提取物組小鼠第4~第5天記憶訓(xùn)練潛伏期顯著短于模型對照組。說明這3種主原料均有提升記憶力的效果，且元寶楓籽油效果相對較好，故選擇元寶楓籽油為必備功效成分，復(fù)配DHA和（或）酸棗仁提取物，以確定產(chǎn)品功效成分及最佳配比。

圖1 元寶楓籽油、DHA和酸棗仁提取物3種主原料對乙醇致小鼠記憶再現(xiàn)障礙的影響

2.1.2 不同配方的提升記憶力效果

如圖2所示，與正常對照組比較，模型對照組小鼠于第1，第3~第5天學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練潛伏期顯著延長，而配方3組小鼠于第1，第3和第5天記憶訓(xùn)練潛伏期顯著短于模型對照組，配方5組小鼠于第1，第3和第4天記憶訓(xùn)練潛伏期顯著短于模型對照組，其余配方效果一般。結(jié)果表明配方3和配方5均有提升記憶力的效果，且配方3效果相對更好。

圖2 各配方組對乙醇致小鼠記憶再現(xiàn)障礙的影響

2.1.3 最優(yōu)配方與競品的提升記憶力效果的對比

分析圖3，從第2天開始到第5天訓(xùn)練期，與正常對照組比較，模型對照組小鼠學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練潛伏期顯著延長。與模型對照組相比，配方3組小鼠學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練潛伏期顯著縮短。競品1組和競品2組小鼠學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練潛伏期并沒有顯著縮短。并且，在第2和第3天訓(xùn)練期，配方3組小鼠記憶訓(xùn)練潛伏期顯著短于競品1組小鼠記憶訓(xùn)練潛伏期。說明研發(fā)的配方3產(chǎn)品與市售產(chǎn)品相比，在輔助改善記憶力的作用顯著。

圖3 配方3與2款競品對乙醇致小鼠記憶再現(xiàn)障礙的影響

2.2 最優(yōu)配方改善記憶的機(jī)制研究

2.2.1 腦切片H-E染色

如圖4所示，在正常對照組中，海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞排列緊密，未見細(xì)胞丟失。且細(xì)胞呈圓形且完整，細(xì)胞核染色明顯，呈深藍(lán)色。相反，模型對照組海馬區(qū)有明顯的損傷，CA3區(qū)部分神經(jīng)元丟失，神經(jīng)元核固縮，呈深嗜堿性。這些異常情況可通過灌胃配方3而得到改善。綜上所述，配方3可以保護(hù)大腦免受酒精損傷。

圖4 配方3組對海馬CA3區(qū)和大腦皮層區(qū)的影響

2.2.2 腦組織TNF-α和IL-1β含量測定

與正常對照組相比，模型對照組小鼠腦組織中促炎細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1β的水平顯著升高。但與模型對照組小鼠相比，配方3可顯著降低TNF-α和IL-1β水平（圖5），說明配方3可降低腦內(nèi)炎癥。

圖5 配方3對小鼠腦內(nèi)TNF-α和IL-1β水平的影響

2.2.3 腦切片免疫熒光染色

iba-1是腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，若小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，則提示大腦出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[16]。如圖6所示，乙醇可增加大腦中iba-1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，而配方3可以減少腦中iba-1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞，提示該配方可能通過抑制腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而減少腦內(nèi)炎癥。

圖6 配方3組對小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

2.3 產(chǎn)品營養(yǎng)及質(zhì)量檢測

對研發(fā)的元寶楓籽油DHA復(fù)合凝膠糖果進(jìn)行營養(yǎng)及質(zhì)量檢測，結(jié)果顯示（表2），研發(fā)的產(chǎn)品具有品種該有的色澤、形態(tài)、組織，無外來雜質(zhì)，且微生物指標(biāo)及理化指標(biāo)均符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，是一款安全的天然功能產(chǎn)品。

表2 產(chǎn)品檢測結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)以元寶楓籽油、DHA、酸棗仁提取物為主要原料，研制一款具有增強(qiáng)記憶力功能的凝膠糖果，且功效優(yōu)于市場流通較好的2個(gè)競品，具有開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，有望成為因酒精導(dǎo)致記憶力下降和有提高記憶力需求的人群的一種安全無后顧之憂的新選擇。產(chǎn)品可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性和減少炎癥細(xì)胞因子的釋放，從而提高記憶和學(xué)習(xí)能力，保護(hù)大腦免受酒精損傷和記憶障礙。此配方下研制的產(chǎn)品具有品種該有的色澤、形態(tài)、組織，無外來雜質(zhì)，且各項(xiàng)指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。