趙金霞 顏 亮 陳永權(quán)

肺癌為臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤疾病之一，肺癌患者表現(xiàn)出瘤細(xì)胞的侵潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，一定程度上導(dǎo)致當(dāng)前的治療方式（外科切除、放療、化療）效果并不十分理想[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[2]，肺癌患者5年的存活率很低只有17.1%。由于腫瘤轉(zhuǎn)移及其調(diào)控的復(fù)雜性，至今關(guān)于肺癌的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，也尚未找到有效的治療方法。分析其原因可能與肺癌早期癥狀無(wú)特異性、肺癌疾病本身的復(fù)雜性存在關(guān)系。因此，發(fā)現(xiàn)并闡明肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及開(kāi)發(fā)新的治療藥物對(duì)于肺癌的治療至關(guān)重要。近幾年，多項(xiàng)研究均表明肺癌疾病的發(fā)病機(jī)制與多種信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化存在關(guān)系[3]，如表皮生長(zhǎng)因子受體家族（EGFR）、腫瘤抑制因子P53及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）[4]。但是，針對(duì)上述靶點(diǎn)的臨床治療并沒(méi)有取得很好的療效。因此，研究肺癌的發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)更有效的靶向治療藥物對(duì)于提高肺癌的治療效果非常重要。研究稱[5]，以吲哚為基本骨架的化合物已被證明具有抗腫瘤活性。二吲哚甲烷可以通過(guò)抑制腫瘤血管的再生，誘導(dǎo)凋亡并抑制其生長(zhǎng)。上述研究表明吲哚類(lèi)化合物作為抗腫瘤藥物具有潛在價(jià)值。但螺旋吲哚類(lèi)衍生物抗腫瘤活性的研究鮮有報(bào)道。南京大學(xué)化工學(xué)院以雙氧吲哚環(huán)為基本骨架，合成了一種全新的化合物即二吲哚吡啶基吡咯烷（di-indolyl pyrrolidine，DIPRD），可對(duì)AKT磷酸化進(jìn)程發(fā)揮直接調(diào)節(jié)作用，同時(shí)對(duì)絲氨酸殘基473位點(diǎn)主要發(fā)揮抑制作用，對(duì)蘇氨酸殘基308位點(diǎn)主要發(fā)揮激活作用[6]。本文進(jìn)一步探討DIPRD在肺癌A549細(xì)胞增殖中的影響，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 ①細(xì)胞：肺癌A549細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫(kù)）。②試劑：細(xì)胞計(jì)數(shù)（CCK-8）增殖檢測(cè)試劑盒，蛋白激酶B（Akt）、雷帕霉素機(jī)械靶蛋白（mTOR）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（Erk）一抗抗體，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗抗體。DIPRD由南京大學(xué)化工學(xué)院合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇，接種，加10%胎牛血清、抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，再置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，環(huán)境條件為37 ℃、5%CO2，依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況換液處理。

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞活性 使用濃度為0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的DIPRD處理A549細(xì)胞24 h，運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。獲取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，予以適量胰酶消化處理，重懸，計(jì)數(shù)；濃度為0和DIPRD處理組以2000 cells/well接種，100 μL/孔，另設(shè)6個(gè)空白孔；置于37 ℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)；CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性。CCK-8檢測(cè)方法：細(xì)胞終止前4 h，予以CCK-8溶液。4 h后吸去培養(yǎng)液，加100 μL二甲基亞砜（DMSO）溶解。振蕩，酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度（OD）值，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 獲取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，予以適量胰酶消化處理，重懸，計(jì)數(shù)。以每孔100、200、300個(gè)細(xì)胞接種。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次。加純甲醇5 mL固定。然后去固定液，加適量結(jié)晶紫染色液染色15 min，流水洗去染色液，空氣干燥。觀察染色和和克隆大小，計(jì)數(shù)并計(jì)算克隆形成率克隆大小，計(jì)數(shù)并計(jì)算克隆形成率。

1.5 免疫蛋白印跡（western blotting，WB）法檢測(cè)蛋白激酶B（Akt）、雷帕霉素機(jī)械靶蛋白（mTOR）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Erk）蛋白磷酸化水平。獲取A549細(xì)胞，予以50 mg/mL的DIPRD孵育2 h，收集細(xì)胞裂解物。再將其置于4 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，10000 r/min離心5 min，取上清液。蛋白質(zhì)定量試劑盒二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定，加緩沖液，煮沸、冷卻、上樣。經(jīng)SDS-PAGE（10%）電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。再將PVDF膜置于含有TBST（TBS+Tween-20）的脫脂奶封閉液，1 h。加入一抗（1:1000），孵育過(guò)夜。TBST清洗（6次×5 min）。加入二抗，1 h后，TBST清洗（6次×5 min）。再將PVDF膜置于暗盒，加入顯影液，檢測(cè)條帶。

1.6 觀察指標(biāo) 統(tǒng)計(jì)不同濃度0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的DIPRD孵育A549細(xì)胞，孵育24 h以后，肺癌A549細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖以及A549細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白（p-Akt、p-mTOR、p-Erk）表達(dá)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將本次研究數(shù)據(jù)錄入到SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DIPRD對(duì)肺癌A549細(xì)胞活力影響 25 μg/mL及以上濃度的二吲哚吡啶基吡咯烷孵育后可明顯抑制A549細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖。見(jiàn)表1。

表1 A549細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖（）

表1 A549細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖（）

注：與0 μg/mL比較，?P＜0.05

組別(μg/mL)實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)A549細(xì)胞活力A549細(xì)胞增殖0 3 1.00±0.05 1.00±0.02 6.25 3 0.99±0.02 0.94±0.02 12.5 3 0.98±0.01 0.92±0.01 25 3 0.76±0.02? 0.80±0.02?50 3 0.70±0.01? 0.75±0.01?100 3 0.51±0.02? 0.67±0.02?F 1271.479 321.965 P＜0.001 ＜0.001

2.2 DIPRD對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的影響 25 μg/mL及以上濃度的二吲哚吡啶基吡咯烷孵育后可明顯下調(diào)p-Akt、p-mTOR、p-Erk表達(dá)。見(jiàn)表2。

表2 DIPRD對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的影響（）

表2 DIPRD對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的影響（）

注：與0 μg/mL比較，?P＜0.05

組別(μg/mL)實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù) p-Akt p-mTOR p-Erk 0 3 1.00±0.05 1.00±0.02 1.00±0.07 6.25 3 0.99±0.07 0.98±0.05 0.97±0.06 12.5 3 0.98±0.04 0.80±0.05 0.85±0.03 25 3 0.73±0.04? 0.75±0.04? 0.72±0.05?501 3 0.70±0.03? 0.68±0.03? 0.67±0.04?100 3 0.41±0.02? 0.50±0.05? 0.48±0.03?F 672.869 222.321 200.110 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討 論

前期研究中，發(fā)現(xiàn)DIPRD可通過(guò)影響乳腺癌細(xì)胞周期抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[7]。由此進(jìn)一步預(yù)測(cè)DIPRD可能對(duì)肺癌細(xì)胞增殖也存在抑制作用，因此，為了進(jìn)一步證實(shí)此預(yù)測(cè)以及分析可能存在的分子機(jī)制，本次研究予以不同濃度（0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL）的DIPRD孵育肺癌A549細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DIPRD可以有效抑制A549細(xì)胞活力以及細(xì)胞增殖，尤其在濃度達(dá)到25 μg/mL后，便可以明顯發(fā)揮對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制作用。

研究顯示[8]，肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過(guò)程與Akt/mTOR/ERK通路存在關(guān)系，且該信號(hào)通路中相關(guān)蛋白分子可作為腫瘤疾病治療靶點(diǎn)。mTOR屬于一類(lèi)Ser/Thr蛋白激酶，常作為ATP一級(jí)氨基酸水平的傳感器用于平衡細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。mTOR在Ser2448殘基處偶聯(lián)PI3激酶/Akt信號(hào)途徑磷酸化，在營(yíng)養(yǎng)平衡及細(xì)胞正常生長(zhǎng)中均具有重要作用[10]。由此，mTOR常作為抗腫瘤治療靶點(diǎn)。ERK屬于有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）家族中關(guān)鍵一員，可參與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡等。ERK蛋白相關(guān)通路被激活以后，其被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、磷酸化進(jìn)程，同時(shí)參與多種關(guān)鍵酶的激活，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[11]。另外ERK的激活也可促進(jìn)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）配體水平，因此，ERK可能為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)重要一環(huán)。目前多項(xiàng)研究均表明ERK可作為多種腫瘤疾病治療靶點(diǎn)[12]。本次研究進(jìn)一步檢測(cè)了不同濃度DIPRD處理后的肺癌A549細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DIPRD可以有效抑制p-Akt、p-mTOR、p-Erk表達(dá)，此項(xiàng)研究結(jié)果進(jìn)一步表明Akt/mTOR/Erk可能是DIPRD抑制肺癌A549細(xì)胞增殖的靶點(diǎn)。

綜上所述，DIPRD可以有效抑制肺癌A549細(xì)胞增殖，此種作用分子機(jī)制可能與抑制Akt、mTOR及Erk蛋白磷酸化水平存在關(guān)系。但是本次研究也存在一些不足，尚未觀察不同濃度DIPRD對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡及其他生物學(xué)行為的影響以及可能存在的具體分子機(jī)制。本次研究一定程度上為此類(lèi)新合成的化合物具有抗腫瘤作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，關(guān)于DIPRD抑制肺癌A549細(xì)胞增殖的分子價(jià)值有待進(jìn)一步研究。