王芳，曹璐，秦菁菁，林宇豐，許秀美，張政兵，李新文，李毅，程毅，孫正祥

(1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所/南方經(jīng)濟(jì)作物研究中心，湖南 長沙 410221；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物與保護(hù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；5.湖南省植保植檢站，湖南 長沙 410006)

大麻(Cannabis sativaL.)是我國傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)作物，目前為止，科研人員已從大麻植株中提取并鑒定出560 多種化學(xué)功能成分[1]。 大麻二酚因其潛在的治療作用，包括保護(hù)神經(jīng)、抗癲癇、抗癌癥[2]及抑菌消炎[3]等功效而愈來愈被看好。 我國大麻種植區(qū)廣闊，逐漸形成南部地區(qū)以花葉為主、東北地區(qū)以纖維為主、中部地區(qū)以籽粒為主的產(chǎn)業(yè)布局[4]。 大麻白絹病是由半知菌齊整小核菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)引起的一種嚴(yán)重土傳病害，主要危害植株莖基部和根部，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)常導(dǎo)致整株枯死。

目前大麻白絹病的防治方式主要是輪作、土壤消毒以及施用化學(xué)農(nóng)藥，但該病菌可以以菌核形態(tài)在土壤中存活多年，部分藥物雖有一定的防效，但長期使用化學(xué)藥劑容易產(chǎn)生耐藥性。 因此，挖掘安全、綠色的生防微生物資源，開發(fā)新型生物防治辦法意義重大。 柴阿麗等[5]從土壤中分離得到一株副地衣芽孢桿菌(Bacillus paralicheniformis)ZF480，該菌株對(duì)十字花科根腫病有良好防治作用，且該菌株對(duì)鐮孢菌和黃單胞野油菜變種也有較好的抑制作用。 王亞嬌等[6]從西瓜根圍土中分離獲得一株對(duì)西瓜枯萎病具有防治效果的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)SFJ11，該菌株可以分泌多種胞外水解酶，如蛋白酶和纖維素酶等，此外，該菌株在大田試驗(yàn)中防治效果可達(dá)78%，其防效顯著高于多菌靈的(55.45%)。 許麗婷等[7]從馬鈴薯根際土中獲得一株對(duì)立枯絲核菌有較強(qiáng)拮抗作用的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)XC-1，該菌株通過造成立枯絲核菌菌絲斷裂而抑制菌絲生長。 大田試驗(yàn)表明，菌株XC-1 在馬鈴薯收獲期對(duì)馬鈴薯黑痣病生防效果達(dá)到54.51%。 植物內(nèi)生菌不僅應(yīng)用于生物防治，其內(nèi)生菌本身還可以產(chǎn)生與植物相同或相似的生物活性物質(zhì)，一般認(rèn)為抑菌活性物質(zhì)的合成和分泌是細(xì)菌最重要的生物防治機(jī)制之一，活性物質(zhì)如表面活性素、脂肽類物質(zhì)等都可作為藥劑開發(fā)利用。 于洪升等[8]從銀杏植株中篩選到一株粗提物有較好抗真菌活性的青霉屬真菌，該真菌粗提物對(duì)紅色毛蘚菌的抗菌活性與陽性對(duì)照化學(xué)藥劑氟康唑的抗菌活性相當(dāng)，這一發(fā)現(xiàn)為尋找新的抗菌活性化合物代替原有化學(xué)藥劑開辟了新的途徑。QIN 等[9]從熱帶雨林中的植物里獲得一株具有抗菌活性的放線菌，為新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)提供了新的方向。

課題組人員從云南省工業(yè)大麻種植區(qū)的健康大麻葉片組織中分離出多株內(nèi)生生防菌，其中一株對(duì)大麻白絹病菌具有顯著拮抗作用。 本研究對(duì)該菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、分子鑒定、生理生化特征測(cè)定研究，并結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化該菌株發(fā)酵條件，旨在分離大麻內(nèi)生細(xì)菌，并從中篩選挖掘大麻白絹病生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料

大麻植株葉片，用于分離大麻內(nèi)生菌；

供試菌株:大麻白絹病菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)(工業(yè)大麻葉片內(nèi)生菌)，用于篩選大麻白絹病原生防菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(Luria-Bertani 培養(yǎng)基/LB 培養(yǎng)基):蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，PH 7.0～7.2；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextroseagar，PDA):土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，PH 7.0～7.2；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:牛肉膏8 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0～7.2。

1.1.3 供試土壤

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湘輝農(nóng)業(yè)技術(shù)中心研制通用型營養(yǎng)基質(zhì)土。

1.1.4 主要試劑和儀器

恒溫培養(yǎng)箱:SPX-250B-Z 型，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；超低溫冰箱:DW-HL528型，中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；梯度PCR 儀:T100TM Thermal Cycler 型，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；電泳儀:DYY-6C 型，北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng):Tanon 2500 型，上海天能科技有限公司。

細(xì)菌基因組提取試劑盒(TIANamp Bacterial DNA Kit):擎科生化科技有限公司購買；細(xì)菌鑒定常用引物、PCRmix 及DNA marker:擎科基因股份有限公司提供。

1.2 生防菌的分離篩選和鑒定

收集健康工業(yè)大麻植株葉片，選取1 g 葉片組織，搗碎后置于9 mL 無菌水中，漩渦振蕩。 將懸浮液稀釋為10-1、10-2以及10-3三個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度吸取100 μL 懸浮液涂布至LB 固體培養(yǎng)基平板上，重復(fù)3 次。 平板放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)36 h，挑選菌落劃線純化。 采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法將大麻白絹病菌菌餅(直徑為6 mm)接種于PDA 平板(半徑為4.5 cm)中心，將生防菌點(diǎn)接至距平板中心2.5 cm 處，以點(diǎn)接無菌液體培養(yǎng)基的平板為陰性對(duì)照組，以點(diǎn)接藥劑苯醚甲環(huán)唑(100 倍、200 倍、400 倍和800 倍)的平板為陽性對(duì)照[10]，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。 2 d 后對(duì)照組菌落長滿全皿，測(cè)量點(diǎn)接生防菌平板菌絲生長半徑。

1.3 024A 菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

將內(nèi)生菌024A 接種到LB 固體平板上，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，光學(xué)顯微鏡下觀察菌落生長形態(tài)；吸取OD600為0.8 的培養(yǎng)物，離心后棄培養(yǎng)基，收集菌體沉淀于管底，用1×PBS 緩沖液洗2 次，棄上清，沿管壁緩慢加入4 ℃預(yù)冷的戊二醛固定液，采用掃描電鏡進(jìn)行形態(tài)顯微觀察。

1.3.2 生理生化鑒定

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第9 版)對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3.3 16S rDNA 基因序列分析

采用煮沸法提取細(xì)菌DNA[11]；細(xì)菌擴(kuò)增通用引物:B27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和U1492R(5′GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)；PCR 反應(yīng)體系(25 μL):Supper Mix 22 μL，DNA模板1 μL，引物(10 mol/L)各1 μL；反應(yīng)條件:98 ℃5 min；98 ℃30 s，56 °C 30 s，72 ℃1 min，32個(gè)循環(huán)；4 ℃保存；擴(kuò)增產(chǎn)物送至擎科生物公司，序列在GenBank 中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，采用MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株024A 對(duì)大麻白絹病的盆栽防效測(cè)定

在PDA 平板上培養(yǎng)大麻白絹病原菌3 d，在菌絲長滿培養(yǎng)皿后，用無菌打孔器取直徑6 mm 的菌餅。 用無菌針刺傷工業(yè)大麻根部，將菌餅置于基部附近，裹上無菌棉球并噴濕(有利于大麻白絹病菌發(fā)病)。 試驗(yàn)共設(shè)2 個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置9 盆長勢(shì)相似的大麻幼苗，每盆生長有1 株大麻幼苗。接種病原菌后處理組于大麻根基部(土壤表面)噴施20 mL 024A 菌液，菌液濃度達(dá)1.0×107cfu/mL，以噴施等體積無菌培養(yǎng)液為對(duì)照。 幼苗放置于(24±0.2)℃溫室中生長，在處理后第3 天，參照YANG等[12]方法并加以改進(jìn)，計(jì)算病情指數(shù)和相對(duì)防效。 大麻白絹病病情指數(shù)分級(jí)如下[13]:

0 級(jí):無病斑；

1 級(jí):枯萎范圍較小，占根莖比例少于1/4；

2 級(jí):枯萎范圍較大，占根莖比例達(dá)1/4～1/3；

3 級(jí):枯萎范圍極大，占根莖比例達(dá)1/3～3/4；

4 級(jí):成株枯萎，根部壞死。

病情指數(shù)=∑(各級(jí)病株數(shù)×病情級(jí)別數(shù))/(植株總株數(shù)×最高病情級(jí)別數(shù))×100。

相對(duì)防治效果(%)=(1-處理組病情指數(shù)/對(duì)照組病情指數(shù))×100%。

1.5 菌株024A 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果

以大麻白絹病菌為靶標(biāo)菌，采用平板對(duì)峙法測(cè)定024A 菌株發(fā)酵液對(duì)大麻白絹病菌的抑菌率，并在波長600 nm 下測(cè)定024A 菌株發(fā)酵液的OD值，結(jié)合兩者檢測(cè)不同試驗(yàn)設(shè)計(jì)下菌株024A 抑菌活性，每個(gè)處理進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.5.2 單因素法篩選最優(yōu)碳源、氮源

利用單因素試驗(yàn)尋找發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)碳源和氮源。 碳源供選擇種類有葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油和麥芽糖，濃度為2%；氮源供選擇種類有胰蛋白胨、牛肉粉、酵母浸出粉、氯化銨，濃度為1%。024A 菌株種子液接種量為2%，將種子液接入裝有10 mL 培養(yǎng)基的錐形瓶(50 mL)中，28 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌株024A 在波長600 nm 處吸光度及024A 對(duì)大麻白絹病菌抑菌率，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.5.3 Box-Behnken Design 設(shè)計(jì)

應(yīng)用Design-Expert 軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，以前期獲得的最優(yōu)碳源(A)、最優(yōu)氮源(B)、發(fā)酵溫度(C)和發(fā)酵時(shí)間(D)為影響因素，菌株024A 對(duì)大麻白絹病菌抑菌率(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行4 因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)(表1)，試驗(yàn)分25 組進(jìn)行，包括3 個(gè)中心點(diǎn)重復(fù)。 通過Design-Expert 軟件基于二次多項(xiàng)式回歸模型建立設(shè)計(jì)空間。

表1 Box-Behnken 中心組合因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in Box-Behnken center-united experiment design

1.5.4 結(jié)果分析

應(yīng)用Design-Expert V8.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，方差分析和回歸方程采用F檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，p＜0.05 代表差異顯著。 采用R2表示多元回歸模型擬合度，R2＞0.9 判斷為優(yōu)。p＞0.05說明擬合度失擬(Lack of Fit)不顯著，表明回歸模型與數(shù)據(jù)擬合良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌的分離和篩選

從大麻植株的葉片組織中分離篩選到多株對(duì)大麻白絹病原菌有拮抗作用的內(nèi)生菌。 其中，菌株024A 對(duì)白絹病菌的抑制率最高，達(dá)到75.0%(圖1)，顯著高于陽性對(duì)照苯醚甲環(huán)唑藥劑稀釋液處理的平板對(duì)峙(表2)。

圖1 菌株024A 對(duì)大麻白絹病原菌的拮抗結(jié)果Fig.1 Inhibitory effect of strain 024A on mycelial growth of Athelia rolfsii

圖2 藥劑苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ舐榘捉伈〔≡霓卓菇Y(jié)果Fig.2 Antagonistic results of difenoconazole against pathogen of cannabis southern blight

表2 024A 及醚甲環(huán)唑藥劑稀釋液對(duì)辣椒白絹的平板對(duì)峙結(jié)果Table 2 Plate confrontation results of 024A and diluent of ether methylcyclazole on Athelia rolfsii

2.2 024A 菌株的菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

將菌株024A 在LB 固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)1 d，菌株024A 的菌落呈乳白色，圓形或橢圓形，表面光滑，邊緣規(guī)則(圖3A)，2 d 后024A 表面變干燥，呈褶皺狀。 其革蘭氏染色結(jié)果呈陽性(圖3B)，通過掃描電子顯微鏡觀察菌株024A 的超微結(jié)構(gòu)，在電鏡下024A 菌體為桿狀(圖3C)。

圖3 菌株024A 的菌落形態(tài)及掃描電鏡觀察Fig.3 Colony morphology and scanning electron microscopic observation of strain 024A

2.2.2 生理生化特征

參照芽孢桿菌的生理生化特性，對(duì)024A 的氧化酶反應(yīng)、接觸酶和水解明膠等生理生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，菌株024A 能分解利用D-葡萄糖、蔗糖，可以水解明膠和淀粉，接觸酶反應(yīng)、氧化酶反應(yīng)呈陽性，吲哚試驗(yàn)和檸檬酸鹽還原反應(yīng)呈陰性(表3)。

表3 024A 生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain 024A

2.2.3 024A 16S rDNA 分子鑒定:

通過DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和測(cè)序獲得024A16S rDNA 基因片段，該片段在GenBank 上進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，該菌株與Bacillus velezensis(OP435762.1)序列相似性達(dá)到100%。 利用芽孢桿菌屬不同種菌株的16S rDNA 基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)菌株024A 與貝萊斯芽孢桿菌具有較高同源性，同源性達(dá)91%(圖4)。

圖4 基于16S rDNA 基因序列構(gòu)建菌株024A 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain 024A based on 16S rDNA sequence

結(jié)合形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果，確定菌株024A 為貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis，上傳數(shù)據(jù)至GenBank，其登錄號(hào)為OP477121.1。

2.3 生防菌溫室防效試驗(yàn)結(jié)果

在工業(yè)大麻幼苗期刺傷根部后接種2 塊大麻白絹病菌菌餅，024A 菌液灌根處理，澆灌同體積無菌水作對(duì)照。 結(jié)果顯示，接種工業(yè)大麻白絹病菌6 d 后，對(duì)照組幾乎完全發(fā)病，發(fā)病率和病情指數(shù)分別為77.8%與75.0，而處理組分別為22.2%與19.4(圖5)，024A 相對(duì)防效為32.24%(表4)。表明菌株024A 對(duì)大麻白絹病具有良好的防效。

圖5 生防菌024A 對(duì)大麻白絹病的生防效果Fig.5 Control effect of strain 024A on industrial hemp southern blight disease

表4 內(nèi)生菌024A 對(duì)大麻白絹病防治效果Table 4 Control effect of endophytic bacteria 024A on industrial hemp southern blight

2.4 024A 菌株優(yōu)化

2.4.1 氮源、碳源優(yōu)化

最佳氮源和最佳碳源優(yōu)化結(jié)果如圖6、表5、表6。 其中葡萄糖作為碳源時(shí)抑菌率和OD600值均達(dá)到最大(表4)，故選擇葡萄糖作為發(fā)酵碳源。 隨葡萄糖濃度增加，024A 細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)(圖6a)，葡萄糖濃度達(dá)到10 g/L 時(shí)細(xì)胞數(shù)達(dá)到峰值，所以斜面響應(yīng)試驗(yàn)葡萄糖濃度取10 g/L為零水平。 酵母粉作為氮源時(shí)抑菌率和OD600值均達(dá)到最大(表6)，故選擇酵母粉作為發(fā)酵碳源。 隨酵母粉濃度的增加，024A 細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)(圖6b)，酵母粉濃度達(dá)到15 g/L時(shí)細(xì)胞數(shù)達(dá)到峰值，所以斜面響應(yīng)試驗(yàn)葡萄糖濃度取15 g/L 為零水平。

圖6 氮源、碳源優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Optimization results of nitrogen and carbon sources

表5 不同碳源對(duì)菌株生長量及抑菌率的影響Table 5 Effects of different carbon sources on strain growth and inhibition rate

表6 不同氮源對(duì)菌株生長量及抑菌率的影響Table 6 Effects of different nitrogen sources on strain growth and inhibition rate

2.4.2 024A 發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

結(jié)合碳源與氮源優(yōu)化結(jié)果，通過Design-Expert 軟件基于二次多項(xiàng)式回歸模型建立設(shè)計(jì)空間，試驗(yàn)結(jié)果見表7、8。 結(jié)果表明，當(dāng)酵母粉濃度14.12 g/L、葡萄糖濃度11.84 g/L、發(fā)酵溫度31.56 ℃、發(fā)酵時(shí)間17.91 h 時(shí)，菌株024A 達(dá)到最優(yōu)發(fā)酵條件。 擬合得到二次回歸數(shù)學(xué)模型:Y=-630.85+22.19A+6.56B+24.00C+18.31D-0.04AB-0.04AC-0.12AD+0.06BC-0.01BD-0.11CD-0.64A2-0.37B2-0.371C2-0.39D2，該模型中，相關(guān)系數(shù)R2=0.95，說明該模型擬合較好，模型回歸極顯著(p＜0.000 1)，說明該模型可用于024A 發(fā)酵濾液抑菌率的預(yù)測(cè)。F值分析結(jié)果表明，4 個(gè)要素對(duì)抑菌率均有顯著影響，且每兩個(gè)因素之間存在一定的交互作用。 方程失擬項(xiàng)為1.98＞0.05，表明其失擬不顯著，說明模型較穩(wěn)定，能夠很好地進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表7 Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及菌株024A 發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Design of Box-Behnken center-united experimentandresults of fermentation optimization test of strain 024A

表8 回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 8 Variance analysis of regression model and significance test

由圖7A、7B、7C 可知，酵母粉濃度取值一定時(shí)，隨著葡萄糖濃度由5 g/L 增加到15 g/L、培養(yǎng)溫度由27 ℃升高至33 ℃、培養(yǎng)時(shí)間由12 h 延長至20 h，024A 菌株對(duì)大麻白絹病菌抑菌率都表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)；由圖7A 及7D、7E 可知，葡萄糖濃度取值一定時(shí)，隨著酵母粉濃度由10 g/L增加到205 g/L、培養(yǎng)溫度由27 ℃升高至33 ℃、培養(yǎng)時(shí)間由12 h 延長至20 h，024A 抑菌率都表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。 而上述結(jié)果的響應(yīng)面分析圖和曲面圖都為凸面圖，說明抑菌率有最大值。 通過求解回歸方程，得到024A 發(fā)酵濾液抑菌率最大時(shí)的發(fā)酵條件為:酵母粉濃度14.12 g/L、葡萄糖濃度11.84 g/L、發(fā)酵溫度31.56 ℃、發(fā)酵時(shí)間17.91 h，預(yù)測(cè)抑菌率最高可達(dá)89.270 3%。

圖7 各影響因素對(duì)024A 抑菌率的響應(yīng)面分析圖及等高線圖Fig.7 Response surface analysis and contour map of influence factors on 024A antibacterial rate

2.4.3 模型驗(yàn)證

根據(jù)前文回歸方程模擬024A 最優(yōu)培養(yǎng)條件，進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，抑菌率分別為87%、86%和90%，平均為87.66%，與預(yù)測(cè)值89.270 3 較接近，證實(shí)了模型的可靠性。 與菌株024A 未進(jìn)行培養(yǎng)基條件優(yōu)化時(shí)的平板對(duì)峙抑菌率(75.00%)相比，優(yōu)化后024A 的抑菌率提高了12.60%。 優(yōu)化后得到的024A 發(fā)酵條件為:酵母粉濃度14.12 g/L、葡萄糖濃度11.84 g/L、發(fā)酵溫度31.56 ℃、發(fā)酵時(shí)間17.91 h。

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌屬、假單孢菌屬和農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌作為土壤和植物的內(nèi)生微生物，在生物防治中發(fā)揮著重要的作用，貝萊斯芽孢桿菌因其豐富的次生代謝物質(zhì)而應(yīng)用廣泛。 貝萊斯芽孢桿菌不僅可以有效抑制病原菌的生長，且對(duì)植物的生長有促生作用。 張小利等[14]發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌對(duì)草莓白粉病有較好的防效。 王安琪[15]發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌可以顯著促進(jìn)玉蜀黍根部生長。 本試驗(yàn)中貝萊斯芽孢桿菌024A 可以有效抑制大麻白絹病菌生長，盆栽試驗(yàn)中024A 對(duì)大麻白絹病的防效能夠達(dá)到87.1%。

優(yōu)化菌株發(fā)酵條件能使菌株在有限的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生更多功能代謝產(chǎn)物，進(jìn)而提升菌株總體防效和菌株活性物質(zhì)產(chǎn)量。 黃慧婧等[16]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵條件優(yōu)化后的TR-1 上清液對(duì)青枯菌的抑菌率約為優(yōu)化前的2 倍，極大提高了TR-1 發(fā)酵液抑菌效果。 劉京蘭等[17]對(duì)內(nèi)生菌解淀粉芽孢桿菌CC09 產(chǎn)Iturin A 培養(yǎng)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，發(fā)酵條件優(yōu)化后可顯著提高菌株CC09 產(chǎn)抗菌脂肽Iturin A 的能力。 戴蓬博等[18]發(fā)現(xiàn)通過優(yōu)化培養(yǎng)基可以顯著提高極長鏈霉菌菌株SL01 發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性，極大增加菌株SL01 在紫外線條件下抑菌活性的穩(wěn)定性。

前期從工業(yè)大麻葉片組織中分離出多株可以有效抑制大麻白絹病原菌的細(xì)菌。 本研究中菌株024A 對(duì)大麻白絹病菌的平板抑制率最高，抑菌率達(dá)75.0%，遠(yuǎn)高于白絹病常用殺菌劑苯醚甲環(huán)唑(56.1%)抑菌率。 綜合024A 菌株形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16S rDNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，鑒定024A 菌株為貝萊斯芽孢桿菌。 盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，024A 防治效果達(dá)到87.1%，該結(jié)果表明菌株024A 能有效地防治大麻白絹病。 本研究利用單因素試驗(yàn)和斜面響應(yīng)試驗(yàn)對(duì)菌株024A 進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，獲得菌株024A 的最佳發(fā)酵條件:酵母粉濃度14.12 g/L、葡萄糖濃度11.84 g/L、發(fā)酵溫度31.56 ℃、發(fā)酵時(shí)間17.91 h，該條件下的菌株發(fā)酵液對(duì)大麻白絹病菌抑菌率達(dá)87.66%。

本試驗(yàn)通過優(yōu)化024A 發(fā)酵體系，024A 對(duì)大麻白絹病菌的抑制率由75.0%提升到87.6%，顯著提高了貝萊斯芽孢桿菌024A 對(duì)大麻白絹病菌的抑制作用。