王芳，曹璐，秦菁菁，林宇豐，許秀美，張政兵，李新文，李毅，程毅，孫正祥

(1.長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434000；2.中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所/南方經(jīng)濟作物研究中心，湖南 長沙 410221；3.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，湖南 長沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學植物與保護學院，湖南 長沙 410128；5.湖南省植保植檢站，湖南 長沙 410006)

大麻(Cannabis sativaL.)是我國傳統(tǒng)的經(jīng)濟作物，目前為止，科研人員已從大麻植株中提取并鑒定出560 多種化學功能成分[1]。 大麻二酚因其潛在的治療作用，包括保護神經(jīng)、抗癲癇、抗癌癥[2]及抑菌消炎[3]等功效而愈來愈被看好。 我國大麻種植區(qū)廣闊，逐漸形成南部地區(qū)以花葉為主、東北地區(qū)以纖維為主、中部地區(qū)以籽粒為主的產(chǎn)業(yè)布局[4]。 大麻白絹病是由半知菌齊整小核菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)引起的一種嚴重土傳病害，主要危害植株莖基部和根部，發(fā)病嚴重時常導致整株枯死。

目前大麻白絹病的防治方式主要是輪作、土壤消毒以及施用化學農(nóng)藥，但該病菌可以以菌核形態(tài)在土壤中存活多年，部分藥物雖有一定的防效，但長期使用化學藥劑容易產(chǎn)生耐藥性。 因此，挖掘安全、綠色的生防微生物資源，開發(fā)新型生物防治辦法意義重大。 柴阿麗等[5]從土壤中分離得到一株副地衣芽孢桿菌(Bacillus paralicheniformis)ZF480，該菌株對十字花科根腫病有良好防治作用，且該菌株對鐮孢菌和黃單胞野油菜變種也有較好的抑制作用。 王亞嬌等[6]從西瓜根圍土中分離獲得一株對西瓜枯萎病具有防治效果的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)SFJ11，該菌株可以分泌多種胞外水解酶，如蛋白酶和纖維素酶等，此外，該菌株在大田試驗中防治效果可達78%，其防效顯著高于多菌靈的(55.45%)。 許麗婷等[7]從馬鈴薯根際土中獲得一株對立枯絲核菌有較強拮抗作用的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)XC-1，該菌株通過造成立枯絲核菌菌絲斷裂而抑制菌絲生長。 大田試驗表明，菌株XC-1 在馬鈴薯收獲期對馬鈴薯黑痣病生防效果達到54.51%。 植物內(nèi)生菌不僅應用于生物防治，其內(nèi)生菌本身還可以產(chǎn)生與植物相同或相似的生物活性物質(zhì)，一般認為抑菌活性物質(zhì)的合成和分泌是細菌最重要的生物防治機制之一，活性物質(zhì)如表面活性素、脂肽類物質(zhì)等都可作為藥劑開發(fā)利用。 于洪升等[8]從銀杏植株中篩選到一株粗提物有較好抗真菌活性的青霉屬真菌，該真菌粗提物對紅色毛蘚菌的抗菌活性與陽性對照化學藥劑氟康唑的抗菌活性相當，這一發(fā)現(xiàn)為尋找新的抗菌活性化合物代替原有化學藥劑開辟了新的途徑。QIN 等[9]從熱帶雨林中的植物里獲得一株具有抗菌活性的放線菌，為新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)提供了新的方向。

課題組人員從云南省工業(yè)大麻種植區(qū)的健康大麻葉片組織中分離出多株內(nèi)生生防菌，其中一株對大麻白絹病菌具有顯著拮抗作用。 本研究對該菌株進行了形態(tài)學、分子鑒定、生理生化特征測定研究，并結(jié)合單因素試驗和響應面法優(yōu)化該菌株發(fā)酵條件，旨在分離大麻內(nèi)生細菌，并從中篩選挖掘大麻白絹病生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料

大麻植株葉片，用于分離大麻內(nèi)生菌；

供試菌株:大麻白絹病菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)(工業(yè)大麻葉片內(nèi)生菌)，用于篩選大麻白絹病原生防菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(Luria-Bertani 培養(yǎng)基/LB 培養(yǎng)基):蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，PH 7.0～7.2；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextroseagar，PDA):土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，PH 7.0～7.2；發(fā)酵基礎培養(yǎng)基:牛肉膏8 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0～7.2。

1.1.3 供試土壤

湖南農(nóng)業(yè)大學湘輝農(nóng)業(yè)技術中心研制通用型營養(yǎng)基質(zhì)土。

1.1.4 主要試劑和儀器

恒溫培養(yǎng)箱:SPX-250B-Z 型，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；超低溫冰箱:DW-HL528型，中科美菱低溫科技有限責任公司；梯度PCR 儀:T100TM Thermal Cycler 型，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司；電泳儀:DYY-6C 型，北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng):Tanon 2500 型，上海天能科技有限公司。

細菌基因組提取試劑盒(TIANamp Bacterial DNA Kit):擎科生化科技有限公司購買；細菌鑒定常用引物、PCRmix 及DNA marker:擎科基因股份有限公司提供。

1.2 生防菌的分離篩選和鑒定

收集健康工業(yè)大麻植株葉片，選取1 g 葉片組織，搗碎后置于9 mL 無菌水中，漩渦振蕩。 將懸浮液稀釋為10-1、10-2以及10-3三個濃度梯度，每個濃度吸取100 μL 懸浮液涂布至LB 固體培養(yǎng)基平板上，重復3 次。 平板放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)36 h，挑選菌落劃線純化。 采用平板對峙培養(yǎng)法將大麻白絹病菌菌餅(直徑為6 mm)接種于PDA 平板(半徑為4.5 cm)中心，將生防菌點接至距平板中心2.5 cm 處，以點接無菌液體培養(yǎng)基的平板為陰性對照組，以點接藥劑苯醚甲環(huán)唑(100 倍、200 倍、400 倍和800 倍)的平板為陽性對照[10]，每個處理3 個重復。 2 d 后對照組菌落長滿全皿，測量點接生防菌平板菌絲生長半徑。

1.3 024A 菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)學觀察

將內(nèi)生菌024A 接種到LB 固體平板上，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，光學顯微鏡下觀察菌落生長形態(tài)；吸取OD600為0.8 的培養(yǎng)物，離心后棄培養(yǎng)基，收集菌體沉淀于管底，用1×PBS 緩沖液洗2 次，棄上清，沿管壁緩慢加入4 ℃預冷的戊二醛固定液，采用掃描電鏡進行形態(tài)顯微觀察。

1.3.2 生理生化鑒定

參照《伯杰細菌鑒定手冊》(第9 版)對菌株進行生理生化鑒定。

1.3.3 16S rDNA 基因序列分析

采用煮沸法提取細菌DNA[11]；細菌擴增通用引物:B27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和U1492R(5′GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)；PCR 反應體系(25 μL):Supper Mix 22 μL，DNA模板1 μL，引物(10 mol/L)各1 μL；反應條件:98 ℃5 min；98 ℃30 s，56 °C 30 s，72 ℃1 min，32個循環(huán)；4 ℃保存；擴增產(chǎn)物送至擎科生物公司，序列在GenBank 中進行BLAST 比對，采用MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株024A 對大麻白絹病的盆栽防效測定

在PDA 平板上培養(yǎng)大麻白絹病原菌3 d，在菌絲長滿培養(yǎng)皿后，用無菌打孔器取直徑6 mm 的菌餅。 用無菌針刺傷工業(yè)大麻根部，將菌餅置于基部附近，裹上無菌棉球并噴濕(有利于大麻白絹病菌發(fā)病)。 試驗共設2 個處理，每個處理設置9 盆長勢相似的大麻幼苗，每盆生長有1 株大麻幼苗。接種病原菌后處理組于大麻根基部(土壤表面)噴施20 mL 024A 菌液，菌液濃度達1.0×107cfu/mL，以噴施等體積無菌培養(yǎng)液為對照。 幼苗放置于(24±0.2)℃溫室中生長，在處理后第3 天，參照YANG等[12]方法并加以改進，計算病情指數(shù)和相對防效。 大麻白絹病病情指數(shù)分級如下[13]:

0 級:無病斑；

1 級:枯萎范圍較小，占根莖比例少于1/4；

2 級:枯萎范圍較大，占根莖比例達1/4～1/3；

3 級:枯萎范圍極大，占根莖比例達1/3～3/4；

4 級:成株枯萎，根部壞死。

病情指數(shù)=∑(各級病株數(shù)×病情級別數(shù))/(植株總株數(shù)×最高病情級別數(shù))×100。

相對防治效果(%)=(1-處理組病情指數(shù)/對照組病情指數(shù))×100%。

1.5 菌株024A 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果

以大麻白絹病菌為靶標菌，采用平板對峙法測定024A 菌株發(fā)酵液對大麻白絹病菌的抑菌率，并在波長600 nm 下測定024A 菌株發(fā)酵液的OD值，結(jié)合兩者檢測不同試驗設計下菌株024A 抑菌活性，每個處理進行3 次重復。

1.5.2 單因素法篩選最優(yōu)碳源、氮源

利用單因素試驗尋找發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)碳源和氮源。 碳源供選擇種類有葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油和麥芽糖，濃度為2%；氮源供選擇種類有胰蛋白胨、牛肉粉、酵母浸出粉、氯化銨，濃度為1%。024A 菌株種子液接種量為2%，將種子液接入裝有10 mL 培養(yǎng)基的錐形瓶(50 mL)中，28 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，測定菌株024A 在波長600 nm 處吸光度及024A 對大麻白絹病菌抑菌率，每個處理重復3 次。

1.5.3 Box-Behnken Design 設計

應用Design-Expert 軟件設計試驗方案，以前期獲得的最優(yōu)碳源(A)、最優(yōu)氮源(B)、發(fā)酵溫度(C)和發(fā)酵時間(D)為影響因素，菌株024A 對大麻白絹病菌抑菌率(Y)為響應值，進行4 因素3 水平響應面試驗(表1)，試驗分25 組進行，包括3 個中心點重復。 通過Design-Expert 軟件基于二次多項式回歸模型建立設計空間。

表1 Box-Behnken 中心組合因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in Box-Behnken center-united experiment design

1.5.4 結(jié)果分析

應用Design-Expert V8.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，方差分析和回歸方程采用F檢驗進行顯著性檢驗，p＜0.05 代表差異顯著。 采用R2表示多元回歸模型擬合度，R2＞0.9 判斷為優(yōu)。p＞0.05說明擬合度失擬(Lack of Fit)不顯著，表明回歸模型與數(shù)據(jù)擬合良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌的分離和篩選

從大麻植株的葉片組織中分離篩選到多株對大麻白絹病原菌有拮抗作用的內(nèi)生菌。 其中，菌株024A 對白絹病菌的抑制率最高，達到75.0%(圖1)，顯著高于陽性對照苯醚甲環(huán)唑藥劑稀釋液處理的平板對峙(表2)。

圖1 菌株024A 對大麻白絹病原菌的拮抗結(jié)果Fig.1 Inhibitory effect of strain 024A on mycelial growth of Athelia rolfsii

圖2 藥劑苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ舐榘捉伈〔≡霓卓菇Y(jié)果Fig.2 Antagonistic results of difenoconazole against pathogen of cannabis southern blight

表2 024A 及醚甲環(huán)唑藥劑稀釋液對辣椒白絹的平板對峙結(jié)果Table 2 Plate confrontation results of 024A and diluent of ether methylcyclazole on Athelia rolfsii

2.2 024A 菌株的菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學特征

將菌株024A 在LB 固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)1 d，菌株024A 的菌落呈乳白色，圓形或橢圓形，表面光滑，邊緣規(guī)則(圖3A)，2 d 后024A 表面變干燥，呈褶皺狀。 其革蘭氏染色結(jié)果呈陽性(圖3B)，通過掃描電子顯微鏡觀察菌株024A 的超微結(jié)構(gòu)，在電鏡下024A 菌體為桿狀(圖3C)。

圖3 菌株024A 的菌落形態(tài)及掃描電鏡觀察Fig.3 Colony morphology and scanning electron microscopic observation of strain 024A

2.2.2 生理生化特征

參照芽孢桿菌的生理生化特性，對024A 的氧化酶反應、接觸酶和水解明膠等生理生化指標進行鑒定，結(jié)果顯示，菌株024A 能分解利用D-葡萄糖、蔗糖，可以水解明膠和淀粉，接觸酶反應、氧化酶反應呈陽性，吲哚試驗和檸檬酸鹽還原反應呈陰性(表3)。

表3 024A 生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain 024A

2.2.3 024A 16S rDNA 分子鑒定:

通過DNA 提取、PCR 擴增和測序獲得024A16S rDNA 基因片段，該片段在GenBank 上進行比對，結(jié)果表明，該菌株與Bacillus velezensis(OP435762.1)序列相似性達到100%。 利用芽孢桿菌屬不同種菌株的16S rDNA 基因序列構(gòu)建進化樹，發(fā)現(xiàn)菌株024A 與貝萊斯芽孢桿菌具有較高同源性，同源性達91%(圖4)。

圖4 基于16S rDNA 基因序列構(gòu)建菌株024A 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain 024A based on 16S rDNA sequence

結(jié)合形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果，確定菌株024A 為貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis，上傳數(shù)據(jù)至GenBank，其登錄號為OP477121.1。

2.3 生防菌溫室防效試驗結(jié)果

在工業(yè)大麻幼苗期刺傷根部后接種2 塊大麻白絹病菌菌餅，024A 菌液灌根處理，澆灌同體積無菌水作對照。 結(jié)果顯示，接種工業(yè)大麻白絹病菌6 d 后，對照組幾乎完全發(fā)病，發(fā)病率和病情指數(shù)分別為77.8%與75.0，而處理組分別為22.2%與19.4(圖5)，024A 相對防效為32.24%(表4)。表明菌株024A 對大麻白絹病具有良好的防效。

圖5 生防菌024A 對大麻白絹病的生防效果Fig.5 Control effect of strain 024A on industrial hemp southern blight disease

表4 內(nèi)生菌024A 對大麻白絹病防治效果Table 4 Control effect of endophytic bacteria 024A on industrial hemp southern blight

2.4 024A 菌株優(yōu)化

2.4.1 氮源、碳源優(yōu)化

最佳氮源和最佳碳源優(yōu)化結(jié)果如圖6、表5、表6。 其中葡萄糖作為碳源時抑菌率和OD600值均達到最大(表4)，故選擇葡萄糖作為發(fā)酵碳源。 隨葡萄糖濃度增加，024A 細胞數(shù)呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(圖6a)，葡萄糖濃度達到10 g/L 時細胞數(shù)達到峰值，所以斜面響應試驗葡萄糖濃度取10 g/L為零水平。 酵母粉作為氮源時抑菌率和OD600值均達到最大(表6)，故選擇酵母粉作為發(fā)酵碳源。 隨酵母粉濃度的增加，024A 細胞數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(圖6b)，酵母粉濃度達到15 g/L時細胞數(shù)達到峰值，所以斜面響應試驗葡萄糖濃度取15 g/L 為零水平。

圖6 氮源、碳源優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Optimization results of nitrogen and carbon sources

表5 不同碳源對菌株生長量及抑菌率的影響Table 5 Effects of different carbon sources on strain growth and inhibition rate

表6 不同氮源對菌株生長量及抑菌率的影響Table 6 Effects of different nitrogen sources on strain growth and inhibition rate

2.4.2 024A 發(fā)酵條件響應面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

結(jié)合碳源與氮源優(yōu)化結(jié)果，通過Design-Expert 軟件基于二次多項式回歸模型建立設計空間，試驗結(jié)果見表7、8。 結(jié)果表明，當酵母粉濃度14.12 g/L、葡萄糖濃度11.84 g/L、發(fā)酵溫度31.56 ℃、發(fā)酵時間17.91 h 時，菌株024A 達到最優(yōu)發(fā)酵條件。 擬合得到二次回歸數(shù)學模型:Y=-630.85+22.19A+6.56B+24.00C+18.31D-0.04AB-0.04AC-0.12AD+0.06BC-0.01BD-0.11CD-0.64A2-0.37B2-0.371C2-0.39D2，該模型中，相關系數(shù)R2=0.95，說明該模型擬合較好，模型回歸極顯著(p＜0.000 1)，說明該模型可用于024A 發(fā)酵濾液抑菌率的預測。F值分析結(jié)果表明，4 個要素對抑菌率均有顯著影響，且每兩個因素之間存在一定的交互作用。 方程失擬項為1.98＞0.05，表明其失擬不顯著，說明模型較穩(wěn)定，能夠很好地進行預測。

表7 Box-Behnken 中心組合試驗設計及菌株024A 發(fā)酵優(yōu)化試驗結(jié)果Table 7 Design of Box-Behnken center-united experimentandresults of fermentation optimization test of strain 024A

表8 回歸模型方差分析及顯著性檢驗Table 8 Variance analysis of regression model and significance test

由圖7A、7B、7C 可知，酵母粉濃度取值一定時，隨著葡萄糖濃度由5 g/L 增加到15 g/L、培養(yǎng)溫度由27 ℃升高至33 ℃、培養(yǎng)時間由12 h 延長至20 h，024A 菌株對大麻白絹病菌抑菌率都表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢；由圖7A 及7D、7E 可知，葡萄糖濃度取值一定時，隨著酵母粉濃度由10 g/L增加到205 g/L、培養(yǎng)溫度由27 ℃升高至33 ℃、培養(yǎng)時間由12 h 延長至20 h，024A 抑菌率都表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。 而上述結(jié)果的響應面分析圖和曲面圖都為凸面圖，說明抑菌率有最大值。 通過求解回歸方程，得到024A 發(fā)酵濾液抑菌率最大時的發(fā)酵條件為:酵母粉濃度14.12 g/L、葡萄糖濃度11.84 g/L、發(fā)酵溫度31.56 ℃、發(fā)酵時間17.91 h，預測抑菌率最高可達89.270 3%。

圖7 各影響因素對024A 抑菌率的響應面分析圖及等高線圖Fig.7 Response surface analysis and contour map of influence factors on 024A antibacterial rate

2.4.3 模型驗證

根據(jù)前文回歸方程模擬024A 最優(yōu)培養(yǎng)條件，進行3 次重復實驗驗證，抑菌率分別為87%、86%和90%，平均為87.66%，與預測值89.270 3 較接近，證實了模型的可靠性。 與菌株024A 未進行培養(yǎng)基條件優(yōu)化時的平板對峙抑菌率(75.00%)相比，優(yōu)化后024A 的抑菌率提高了12.60%。 優(yōu)化后得到的024A 發(fā)酵條件為:酵母粉濃度14.12 g/L、葡萄糖濃度11.84 g/L、發(fā)酵溫度31.56 ℃、發(fā)酵時間17.91 h。

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌屬、假單孢菌屬和農(nóng)桿菌屬的細菌作為土壤和植物的內(nèi)生微生物，在生物防治中發(fā)揮著重要的作用，貝萊斯芽孢桿菌因其豐富的次生代謝物質(zhì)而應用廣泛。 貝萊斯芽孢桿菌不僅可以有效抑制病原菌的生長，且對植物的生長有促生作用。 張小利等[14]發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌對草莓白粉病有較好的防效。 王安琪[15]發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌可以顯著促進玉蜀黍根部生長。 本試驗中貝萊斯芽孢桿菌024A 可以有效抑制大麻白絹病菌生長，盆栽試驗中024A 對大麻白絹病的防效能夠達到87.1%。

優(yōu)化菌株發(fā)酵條件能使菌株在有限的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生更多功能代謝產(chǎn)物，進而提升菌株總體防效和菌株活性物質(zhì)產(chǎn)量。 黃慧婧等[16]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵條件優(yōu)化后的TR-1 上清液對青枯菌的抑菌率約為優(yōu)化前的2 倍，極大提高了TR-1 發(fā)酵液抑菌效果。 劉京蘭等[17]對內(nèi)生菌解淀粉芽孢桿菌CC09 產(chǎn)Iturin A 培養(yǎng)發(fā)酵條件進行優(yōu)化，結(jié)果顯示，發(fā)酵條件優(yōu)化后可顯著提高菌株CC09 產(chǎn)抗菌脂肽Iturin A 的能力。 戴蓬博等[18]發(fā)現(xiàn)通過優(yōu)化培養(yǎng)基可以顯著提高極長鏈霉菌菌株SL01 發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性，極大增加菌株SL01 在紫外線條件下抑菌活性的穩(wěn)定性。

前期從工業(yè)大麻葉片組織中分離出多株可以有效抑制大麻白絹病原菌的細菌。 本研究中菌株024A 對大麻白絹病菌的平板抑制率最高，抑菌率達75.0%，遠高于白絹病常用殺菌劑苯醚甲環(huán)唑(56.1%)抑菌率。 綜合024A 菌株形態(tài)學、生理生化特性以及16S rDNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，鑒定024A 菌株為貝萊斯芽孢桿菌。 盆栽試驗結(jié)果表明，024A 防治效果達到87.1%，該結(jié)果表明菌株024A 能有效地防治大麻白絹病。 本研究利用單因素試驗和斜面響應試驗對菌株024A 進行發(fā)酵條件優(yōu)化，獲得菌株024A 的最佳發(fā)酵條件:酵母粉濃度14.12 g/L、葡萄糖濃度11.84 g/L、發(fā)酵溫度31.56 ℃、發(fā)酵時間17.91 h，該條件下的菌株發(fā)酵液對大麻白絹病菌抑菌率達87.66%。

本試驗通過優(yōu)化024A 發(fā)酵體系，024A 對大麻白絹病菌的抑制率由75.0%提升到87.6%，顯著提高了貝萊斯芽孢桿菌024A 對大麻白絹病菌的抑制作用。