李楊，趙曉俊，王璞，張?jiān)茲?，高?/p>

(1. 晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北省植物資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 曲周 057250；2. 騰沖晨光云麻生物科技有限公司，云南 騰沖 679100)

工業(yè)大麻又稱火麻，特指四氫大麻酚(THC)含量低于0.3%的大麻品種，工業(yè)大麻的植株分為雄性和雌性，花的形態(tài)和活性成分具有較大差異。 工業(yè)大麻中的主要生物活性物質(zhì)是大麻素、萜烯、類黃酮、植物甾醇等[1-4]。 大麻素主要包括大麻二酚(CBD)、大麻二酚酸、THC、四氫大麻酚酸、次大麻二酚、次大麻二酚酸、大麻萜酚、大麻萜酚酸等[5-6]。 工業(yè)大麻花葉中大麻二酚酸經(jīng)過加熱脫羧可以轉(zhuǎn)化成CBD。 工業(yè)大麻加工過程中不可避免會接觸到高溫、光照、氧氣，從而影響CBD 理化性質(zhì)或生物活性[7-9]。

劉蓓等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在氮?dú)猸h(huán)境中熱處理工業(yè)大麻時，CBD、THC 含量最高，空氣環(huán)境下高溫會導(dǎo)致CBD 和THC 含量降低，其中THC 可以轉(zhuǎn)化為大麻酚，合適的溫度和空氣量可獲得高含量CBD，并有效降低THC 含量。 孫維來等[10]研究認(rèn)為，CBD 對溫度、光照比較敏感，在避光及低溫條件下可穩(wěn)定存在。 張煦然等[11]研究認(rèn)為，CBD 在酸性條件下會轉(zhuǎn)化為精神活性物質(zhì)THC。 Christian[12]研究認(rèn)為，溶劑及光照條件能夠加速CBD 降解。 為了指導(dǎo)工業(yè)大麻實(shí)際生產(chǎn)，需要對工業(yè)大麻加工過程中影響CBD 穩(wěn)定性的因素進(jìn)行研究。 本文模擬影響CBD 穩(wěn)定性的主要因素，以CBD 損失率為指標(biāo)，研究了加工過程中溫度、光照、氧氣等因子對CBD 的影響，旨在為工業(yè)大麻生產(chǎn)加工實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益最大化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

工業(yè)大麻花葉(云麻7 號)，騰沖晨光云麻生物科技有限公司提供；工業(yè)大麻提取液(使用乙醇提取得到)、全譜系油(工業(yè)大麻原料通過乙醇提取、樹脂純化、色譜分離得到)、CBD 晶體(全譜系油通過降溫結(jié)晶得到)，騰沖晨光云麻生物科技有限公司提供；甲醇、乙醇、磷酸、丙酮等均為國產(chǎn)分析純，乙腈為色譜純試劑；CBD 標(biāo)準(zhǔn)品購買自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

DHG-9055A 臺式電熱鼓風(fēng)烘箱，上海右一儀器有限公司；E2695 高效液相色譜儀，美國沃特世科技有限公司；AUY220 分析天平(感量為0.1 mg)，日本島津公司；KQ-500DB 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；R214B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；JJ-1 精密增力電力攪拌器，上海一凱儀器設(shè)備有限公司；DK-S24 恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溫度對CBD 穩(wěn)定性的影響

分別準(zhǔn)確稱量100.00 g 提取液、全譜系油、晶體，避光置于20、80、100、120、140、160、180 ℃下加熱2 h，確定不同溫度下CBD 損失率。 試驗(yàn)重復(fù)5 次。

1.2.2 光照對CBD 穩(wěn)定性的影響

分別準(zhǔn)確移取100.00 g 工業(yè)大麻花葉、全譜系油、晶體，分別置于避光、10 000(±500)lx 環(huán)境中真空密封存放，溫度為25 ℃，分別在3、7、10、30、60、77 d 后測定不同條件下CBD 損失率。 試驗(yàn)重復(fù)5 次。

1.2.3 氧氣對CBD 穩(wěn)定性的影響

準(zhǔn)確稱量100.00 g 工業(yè)大麻花葉、全譜系油、晶體，分別置于真空包裝(含氧量為0)、自封袋(自然封口，測氧儀檢測含氧量20%)，室溫避光下放置3、7、30、60、77 d 后分別檢測CBD 含量，計(jì)算CBD 損失率。 試驗(yàn)重復(fù)5 次。

1.2.4 CBD 含量檢測

取CBD 標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確稱取一定量樣品置于100 mL 容量瓶中，用色譜甲醇溶解定容，混勻，得到定量濃度的大麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液。 使用高效液相色譜儀對本文中樣品進(jìn)行定量檢測[13-17]，樣品使用甲醇稀釋定容。 色譜條件如下，液相色譜柱:C18 150 mm ×4.6 mm，5 μm，柱溫:40 ℃，檢測波長:220 nm，進(jìn)樣量:10 μL，流動相:乙腈—水(V(乙腈)/V(水)= 70 ∶30)，流速:1.0 mL/min。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

CBD 損失率計(jì)算公式如下:

式中:x—CBD 損失率，%；m1—樣品初始CBD 總量，mg；m2—樣品試驗(yàn)后CBD 總量，mg。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 S 為標(biāo)準(zhǔn)方差:

用最小顯著差數(shù)法(LSD)比較相同條件下溫度、光照、氧氣對CBD 含量影響的差異顯著性(p=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CBD 穩(wěn)定性結(jié)果與分析

2.1.1 溫度對CBD 穩(wěn)定性的影響

由圖1～3 可知:80 ℃條件下加熱2 h，提取液中CBD 損失2.46%，全譜系油中CBD 晶體損失0.33%，CBD 晶體中CBD 損失0.42%；當(dāng)溫度超過80 ℃，提取液、全譜系油、CBD 晶體中CBD 隨著溫度升高，損失率逐漸增加；當(dāng)溫度超過140 ℃，損失率急劇增加。 180 ℃條件下加熱2 h，提取液、全譜系油中損失超過35%，CBD 晶體損失4.65%。

圖2 溫度對全譜系油中大麻二酚穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of the cannabinoid in CBD oil

圖3 溫度對大麻二酚晶體穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of temperature on the stability of the cannabinoid crystals

2.1.2 光照對CBD 穩(wěn)定性的影響

由圖4～6 可知:在避光條件下存儲7 周，工業(yè)大麻花葉、CBD 晶體、全譜系油中CBD 損失率小于1%；在光照條件下存儲7 周，全譜系油、原料、CBD 晶體中CBD 含量分別下降9.1%、4.6%、2.0%。 光照對全譜系油中CBD 穩(wěn)定性影響最大，其次是原料中CBD，對CBD 晶體的影響最小。 工業(yè)大麻花葉在避光下10 d 時CBD 含量損失率大于30 d 的，可能與CBD 脫羧轉(zhuǎn)化有關(guān)。

圖4 光照對工業(yè)大麻花葉中大麻二酚穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of light on the stability of industrial hemp flowers and leaves

圖5 光照對大麻二酚晶體穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of light on the stability of the cannabinoid crystals

圖6 光照對全譜系油中大麻二酚穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of light on the stability of the cannabinoid in CBD oil

2.1.3 氧氣對CBD 穩(wěn)定性的影響

由圖7～9 可知，在無氧(避光)條件下，CBD 在工業(yè)大麻花葉、CBD 晶體、全譜系油中損失率小于1%。 氧氣(避光)對原料中CBD 穩(wěn)定性影響較小，存儲4 周下降趨勢較為明顯，含量下降1.3%，第4～11 周，大麻花葉中CBD 含量保持不變；氧氣(避光)對全譜系油中CBD 穩(wěn)定性影響較大，存儲4 周下降趨勢較為明顯，含量下降3.3%，第4 ～11 周，全譜系油中CBD 含量保持不變；氧氣(避光)對CBD 晶體穩(wěn)定性影響較大，隨著存儲時間的延長，CBD 含量逐漸下降，存儲11 周CBD 含量下降3.4%。 工業(yè)大麻花葉在避光下10 d 時CBD 含量損失率大于30 d 的，可能與CBD 脫羧轉(zhuǎn)化有關(guān)。

圖7 氧氣對大麻花葉中大麻二酚穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of oxygen on the stability of industrial hemp flowers and leaves

圖8 氧氣對大麻二酚晶體穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of oxygen on the stability of the cannabinoid crystals

圖9 氧氣對全譜系油中大麻二酚穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of oxygen on the stability of the cannabinoid in CBD oil

2.2 CBD 降解動力學(xué)分析

使用一級動力學(xué)計(jì)算不同溫度下CBD 降解的動力學(xué)參數(shù)，速率常數(shù)k=ln(C0/Ct)/t，半衰期t1/2=ln2/k。 從表1、2 可以看出，溫度越高CBD 降解速率越快，半衰期越短，CBD 在高溫條件下具有更高的不穩(wěn)定性。 提取液中CBD 的降解速率要快于全譜系油和CBD 晶體的，提取液中CBD 的半衰期時間要明顯短于全譜系油和CBD 晶體的，CBD 在全譜系油及CBD 晶體中穩(wěn)定性要明顯好于提取液的，實(shí)際生產(chǎn)過程中，要縮短提取、濃縮時間，濃縮時需要嚴(yán)格控制溫度不超過80 ℃。

表1 不同溫度下CBD 降解速率常數(shù)Table 1 CBD degradation rate constants at different temperatures

表2 不同溫度下CBD 半衰期Table 2 CBD half-life at different temperatures

3 討論

孫維來等[10]研究認(rèn)為，CBD 在避光及低溫條件下可穩(wěn)定存在，因CBD 結(jié)構(gòu)中有酚羥基官能團(tuán)，在光照、高溫以及氧氣條件下生成醌類物質(zhì)，造成含量損失。 劉佳瑩等[18]研究認(rèn)為，因CBD 在光照條件下發(fā)生自由基反應(yīng)，故其存在見光易分解、生物利用度低等問題。 謝志輝等[19]研究認(rèn)為，CBD 微乳液在60 ℃放置3 h 較為穩(wěn)定，溫度越高，CBD 損失程度越大，這與本研究中CBD 在超過80 ℃條件下?lián)p失率會逐漸升高的結(jié)論一致。 本研究發(fā)現(xiàn)，提取液、全譜系油、CBD 晶體在溫度超過80 ℃條件下，隨著溫度的升高，CBD 的損失率逐漸增加。 CBD 在高溫、熱輻射條件下會有自由基反應(yīng)發(fā)生，通過和氧自由基反應(yīng)，得到CBD 自由基，之后同氧氣發(fā)生反應(yīng)，與羥基自由基發(fā)生鏈終止反應(yīng)，得到醌類物質(zhì)和水。 除此之外，在高溫條件下，CBD 中酚羥基上的孤對電子會與雙鍵結(jié)合得到環(huán)狀化合物，之后發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移，生成四氫大麻酚，在生產(chǎn)過程中需要嚴(yán)格控制各工序溫度[20-21]。 工業(yè)大麻花葉、全譜系油、CBD 晶體在氧氣條件下存儲30 d，CBD 會有1%～3%損失，繼續(xù)延長存儲時間，CBD 損失率保持不變。 CBD 本身為酸性物質(zhì)，容易失去氫離子，得到CBD 負(fù)離子化合物，在氧氣條件下發(fā)生反應(yīng)，通過氧化重排反應(yīng)得到醌類物質(zhì)和水，當(dāng)樣品表面接觸氧氣、光照時會在表面形成保護(hù)層，從而使樣品內(nèi)部相對穩(wěn)定，在高溫條件下，樣品持續(xù)加熱，穩(wěn)定性持續(xù)較差，導(dǎo)致CBD 在高溫條件下穩(wěn)定性差。 本研究結(jié)果表明，溫度對CBD 的影響最大，光照、氧氣對CBD 損失率影響相對較小，可能是由于溫度對CBD 氧化反應(yīng)速率影響較大，根據(jù)范特霍夫公式可知，溫度升高10 ℃，其反應(yīng)速率增大為原來的2～4 倍，導(dǎo)致在高溫下，CBD 損失率較大，而光照、氧氣對CBD 中酚羥基上的孤對電子激發(fā)能力較弱，因此表現(xiàn)出在光照、氧氣條件下CBD 損失率較小。 本研究還發(fā)現(xiàn)在相同條件下，不同CBD 樣本呈現(xiàn)不同的損失率，溫度對提取液、全譜系油影響比CBD 晶體更大，由于提取液、全譜系油為混合物，在高溫條件下CBD 更易與其他成分發(fā)生反應(yīng)，從而損失率更大，光照、氧氣對不同CBD 樣品的影響不大，因此在生產(chǎn)加工過程中，尤其要注意料液、全譜系油避免接觸高溫，料液在設(shè)備中一般為避光、密閉傳輸，不需特意隔絕光照、氧氣。 工業(yè)大麻花葉要避免光照，成品需避光、密閉、室溫儲存。

4 結(jié)論

光照和溫度對大麻植物中大麻酚類穩(wěn)定性的影響已有相關(guān)報(bào)道，但對于加工過程中CBD 穩(wěn)定性的影響未見報(bào)道。 本試驗(yàn)研究了加工過程中溫度、光照、氧氣對CBD 穩(wěn)定性的影響:加工過程中溫度超過80 ℃時，原料、全譜系油、晶體中的CBD 會發(fā)生明顯損失，生產(chǎn)過程中脫溶殘時需要較高溫度，可能會影響CBD 含量，因此該環(huán)節(jié)需要嚴(yán)格控制溫度不超過80 ℃；光照對CBD 穩(wěn)定性影響較顯著，在強(qiáng)光下存儲時間越長，CBD 損失越多，因此在原料及產(chǎn)品儲存、加工過程要進(jìn)行避光處理；氧氣是工業(yè)大麻加工過程中導(dǎo)致CBD 損失的一個重要因子，在氧氣條件下存儲時間越長，CBD損失越大，因此在原料及產(chǎn)品儲存、加工過程要進(jìn)行隔氧操作。 為了保證工業(yè)大麻加工過程中CBD 穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益最大化，生產(chǎn)過程中應(yīng)避免溫度超過80 ℃，避免原料及產(chǎn)品長時間接觸氧氣、光照。