晨正宇,周 薇,熊 婧,李 強(qiáng),趙巧丹,梁 棟，艾 成 （.重慶醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院/重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科/胸外科，重慶 40006；.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，重慶 40006；.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬璧山醫(yī)院胸心外科，重慶 40760）

肺癌在全球所有惡性腫瘤中發(fā)病率僅次于乳腺癌，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在肺癌中占比高達(dá)80%[1]。肺癌根治術(shù)是外科治療NSCLC的重要手段，但僅部分患者治愈或長(zhǎng)期生存獲益。既往研究顯示，ⅠA~ⅢB期肺癌患者根治術(shù)后3年及5年生存率僅為54%和46%，說明根治術(shù)后肺癌患者的生存率仍較低[2]。術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是NSCLC患者手術(shù)治療失敗和死亡的主要原因，研究顯示，部分患者即使輔助放化療，其術(shù)后2年復(fù)發(fā)率高達(dá)36%且復(fù)發(fā)患者病死率達(dá)83%[3]。目前，NSCLC術(shù)后常通過影像學(xué)檢查、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)來監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，腫瘤標(biāo)志物水平升高雖可早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，但特異度不高，仍需結(jié)合影像學(xué)檢查進(jìn)一步明確，但當(dāng)影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)病灶時(shí)患者腫瘤負(fù)荷已明顯升高，治療困難，患者病死率極高，因此具有一定局限性[4]。在影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)NSCLC復(fù)發(fā)前，找到能夠有效預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的標(biāo)志物對(duì)指導(dǎo)臨床早期治療、提高患者生存率具有重要意義。分子殘留病灶（minimal residual disease，MRD）概念來源于血液系統(tǒng)腫瘤，指治療后傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查不能發(fā)現(xiàn)的癌來源分子異常。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是游離于血液中的腫瘤細(xì)胞DNA片段，可以跟蹤腫瘤負(fù)荷狀態(tài)，目前常以ctDNA作為MRD的檢測(cè)指標(biāo)，具有評(píng)估腫瘤治療效果及預(yù)后的價(jià)值[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MRD與結(jié)腸癌、乳腺癌等實(shí)體瘤術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)[6-7]，但其在肺癌中的作用有待進(jìn)一步研究。故本研究基于ctDNA檢測(cè)評(píng)估NSCLC患者根治術(shù)后MRD，并分析其對(duì)患者近遠(yuǎn)期生存的預(yù)測(cè)價(jià)值，以期為NSCLC臨床早期預(yù)測(cè)、治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年7月至2017年6月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科行肺癌根治術(shù)治療的114例NSCLC患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性NSCLC，且經(jīng)病理檢查證實(shí)；年齡>18歲；接受肺癌根治術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心、腦、肝、腎等重要器官疾??；合并其他惡性腫瘤；合并急性感染、免疫或血液性疾病；術(shù)前已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；術(shù)前接受放化療、免疫治療等；術(shù)后病理檢查示手術(shù)標(biāo)本切緣陽性。本研究已通過重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（201605-002），所有患者均對(duì)本研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基于ctDNA的MRD檢測(cè) 血樣采集及處理：術(shù)后1周采集患者肘靜脈血10 mL，并于2 h內(nèi)4 ℃下3 000 r/min離心10 min，將上層血漿分裝到離心管中，再次以3 000 r/min離心10 min，去除血細(xì)胞成分，將上層血漿保存到凍存管中備檢。ctDNA的提取及檢測(cè)：采用QIAsymphony DSP循環(huán)DNA試劑盒（德國(guó)Qiagen公司，批號(hào)：1103177）從血漿中提取游離DNA，采用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific）和PicoGreendsDNA定量檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Life Technologies公司，批號(hào)：2475382）檢驗(yàn)游離DNA的質(zhì)量和數(shù)量。文庫構(gòu)建及測(cè)序：采用NEBNext?Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒構(gòu)建文庫，根據(jù)說明書在DNA片段中添加帶有f'f唯一標(biāo)識(shí)符的測(cè)序接頭，采用IlluminaHiseq 3000平臺(tái)對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)樣本平均測(cè)序量為15 GB。生物信息學(xué)分析：采用GATK軟件對(duì)測(cè)序所得reads信息與人類參考基因組hg19比對(duì)進(jìn)行突變分析和注釋，將突變豐度≥0.02%的DNA設(shè)定為ctDNA突變陽性檢出標(biāo)準(zhǔn)，即檢出MRD[8]。依據(jù)檢測(cè)結(jié)果將患者分為MRD陽性組和MRD陰性組。

1.2.2 資料收集 收集NSCLC患者的基本信息（年齡、性別、吸煙史等）、病理資料（病理類型、分化程度、病理分期、腫瘤直徑、縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）和治療情況（手術(shù)方式、術(shù)后化療）。

1.2.3 隨訪術(shù)后 采用電話或門診復(fù)查定期對(duì)患者進(jìn)行隨訪，術(shù)后前3年每3~6個(gè)月隨訪1次，之后每6~12個(gè)月隨訪1次，以2022年6月1日或患者死亡作為隨訪終點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)患者近期（術(shù)后1年）、遠(yuǎn)期（術(shù)后5年）生存率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制MRD陽性和陰性患者的Kaplan-Meier生存曲線，近遠(yuǎn)期生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)；采用單因素和多因素Cox回歸模型分析NSCLC患者術(shù)后近遠(yuǎn)期生存的影響因素。以患者術(shù)后隨訪結(jié)局為金標(biāo)準(zhǔn)，采用四格表法分析MRD檢測(cè)對(duì)患者近遠(yuǎn)期生存的預(yù)測(cè)價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC不同臨床病理特征患者M(jìn)RD陽性率

114例NSCLC患者中有42例（36.84%）MRD陽性。低/未分化、腫瘤直徑>3 cm、縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期ⅢA期的NSCLC患者M(jìn)RD陽性率分別高于高/中分化、腫瘤直徑≤3 cm、無縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ~Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 NSCLC不同臨床病理特征患者M(jìn)RD陽性率比較[例（%）]

2.2 MRD陽性和陰性患者近遠(yuǎn)期生存情況

114例患者術(shù)后1年生存率為83.33%（95/114），5年生存率為52.63%（60/114）；其中術(shù)后1年MRD陽性患者中25例存活、17例死亡，術(shù)后5年3例存活、39例死亡。Kaplan-Meier生存曲線顯示，MRD陽性患者近遠(yuǎn)期生存率均低于MRD陰性患者（Log-rank χ2=28.987、83.630，P<0.001），見圖1。

圖1 MRD陽性和陰性患者術(shù)后遠(yuǎn)期Kaplan-Meier生存曲線

2.3 NSCLC根治術(shù)后近遠(yuǎn)期生存的影響因素分析

將患者性別（女=0，男=1）、年齡（≤65歲=0，>65歲=1）、吸煙史（無=0，有=1）、病理類型（腺癌=0，鱗癌=1，其他=2）、分化程度（高/中分化=0，低/未分化=1）、腫瘤直徑（≤3 cm=0，>3 cm=1）、縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無=0、有=1）、TNM分期（Ⅰ~Ⅱ期=0，ⅢA期=1)、手術(shù)方式（開放式=0、胸腔鏡=1）、化療周期（≤2個(gè)周期=0，>2個(gè)周期=1）、術(shù)后MRD陽性（否=0，是=1）作為自變量，將患者近遠(yuǎn)期生存情況（生存=0，死亡=1）作為因變量進(jìn)行單因素分析，將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入Cox模型中進(jìn)行多因素逐步回歸分析，結(jié)果顯示：低/未分化、腫瘤直徑>3 cm、TNM分期ⅢA期、術(shù)后MRD陽性均是影響NSCLC根治術(shù)后患者近遠(yuǎn)期生存的危險(xiǎn)因素（P<0.05），縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響NSCLC根治術(shù)后遠(yuǎn)期生存的危險(xiǎn)因素（P<0.05），見表2。

2.4 MRD對(duì)NSCLC根治術(shù)后近遠(yuǎn)期生存的預(yù)測(cè)價(jià)值

以NSCLC患者根治術(shù)后隨訪生存結(jié)局作為金標(biāo)準(zhǔn)，探討術(shù)后MRD檢測(cè)結(jié)果作為預(yù)測(cè)指標(biāo)的價(jià)值，結(jié)果顯示術(shù)后MRD預(yù)測(cè)患者術(shù)后近期生存的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為73.68%（70/95）、89.47%（17/19）、76.32%（87/114），預(yù)測(cè)遠(yuǎn)期生存的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為95.00%（57/60）、72.22%（39/54）、84.21%（96/114）。

3 討論

在全球范圍內(nèi)，我國(guó)是肺癌發(fā)病例數(shù)最多的國(guó)家，隨著手術(shù)、放化療等腫瘤治療技術(shù)不斷發(fā)展，肺癌病死率有所下降[9]，但NSCLC患者近遠(yuǎn)期生存率仍不高，本研究中NSCLC患者術(shù)后1年、5年生存率僅為83.33%、52.63%。近年來液態(tài)活檢技術(shù)在惡性腫瘤中的應(yīng)用備受關(guān)注，國(guó)內(nèi)外已有研究證實(shí)血液中ctDNA在腫瘤診療、MRD和預(yù)后評(píng)估中具有巨大潛力[10-12]。因此，基于ctDNA對(duì)NSCLC患者進(jìn)行MRD檢測(cè)來預(yù)測(cè)其術(shù)后生存情況具有重要意義。

既往相關(guān)研究報(bào)道，胃癌Ⅰ~Ⅱ期、Ⅲ期患者ctDNA陽性率分別為21%、68%，胰腺癌轉(zhuǎn)移患者ctDNA陽性率為78.3%，宮頸癌患者ctDNA陽性率為33.3%，且在胃癌、宮頸癌不同病理分期、腫瘤直徑、浸潤(rùn)程度中存在差異[13-15]，提示不同類型惡性腫瘤ctDNA陽性率也有差異。目前普遍認(rèn)為ctDNA主要來源于腫瘤原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶、循環(huán)腫瘤細(xì)胞等，含有拷貝數(shù)變異、缺失、重排、甲基化等腫瘤基因突變信息，多因腫瘤細(xì)胞破裂或凋亡時(shí)釋放入血，且取材方便、檢測(cè)無創(chuàng)、半衰期不到2 h，能夠?qū)崟r(shí)反映腫瘤負(fù)荷和突變信息，監(jiān)測(cè)治療后MRD變化情況[16]。因此，本研究基于ctDNA檢測(cè)MRD，結(jié)果顯示NSCLC患者根治術(shù)后MRD陽性率為36.84%，且低/未分化、腫瘤直徑>3 cm、縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期ⅢA期的NSCLC患者M(jìn)RD陽性率分別高于高/中分化、腫瘤直徑≤3 cm、無縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ/Ⅱ期患者，提示MRD陽性率與NSCLC分化程度、大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)?？紤]可能為低/未分化腫瘤惡性程度高，不僅生長(zhǎng)速度快，還容易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，即使通過手術(shù)切除局部病灶，機(jī)體殘留癌細(xì)胞的可能較大，導(dǎo)致ctDNA含量較高；腫瘤大小與腫瘤浸潤(rùn)、腫瘤分期相關(guān)，并且腫瘤的生長(zhǎng)依賴血管生成，隨著腫瘤增大，新生血管增多，進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞增多[17]；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者手術(shù)難以清掃所有轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，殘留的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)亦會(huì)通過體液循環(huán)散播，導(dǎo)致ctDNA含量增加；TNM分期綜合腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、侵犯范圍等評(píng)估腫瘤進(jìn)展程度，分期越晚越有可能存在浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，術(shù)后腫瘤細(xì)胞殘留可能性越大，故MRD陽性率也越高。

本研究采用Kaplan-Meier生存曲線比較MRD陽性和陰性患者的近遠(yuǎn)期生存率發(fā)現(xiàn)，MRD陽性患者近遠(yuǎn)期生存率均顯著低于MRD陰性患者；經(jīng)Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后MRD陽性、低/未分化、腫瘤直徑>3 cm、TNM分期ⅢA期等均是影響患者近遠(yuǎn)期生存的危險(xiǎn)因素。術(shù)后MRD陽性提示NSCLC患者術(shù)后仍有腫瘤細(xì)胞殘留，這些腫瘤細(xì)胞攜帶有原始腫瘤細(xì)胞的突變基因，仍有可能導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展。Tie等[18]研究顯示，結(jié)腸癌術(shù)后ctDNA檢測(cè)示MRD陽性是影響無復(fù)發(fā)生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=3.8），本研究結(jié)果與之相符，證實(shí)MRD與腫瘤患者生存率密切相關(guān)，是腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物。Chaudhuri等[19]通過檢測(cè)治療后ctDNA識(shí)別MRD評(píng)價(jià)肺癌患者預(yù)后發(fā)現(xiàn)，72%的患者在CT檢查出腫瘤直徑增大前行ctDNA檢查即檢測(cè)到MRD，MRD陽性患者3年內(nèi)均發(fā)生疾病進(jìn)展，MRD陽性患者無進(jìn)展生存率和總生存率均明顯低于陰性患者，說明基于ctDNA的MRD檢測(cè)是早期識(shí)別肺癌治療后進(jìn)展的重要方法，可能對(duì)術(shù)后生存具有預(yù)測(cè)價(jià)值。故本研究進(jìn)一步分析術(shù)后MRD預(yù)測(cè)NSCLC患者根治術(shù)后近遠(yuǎn)期生存的價(jià)值，發(fā)現(xiàn)其預(yù)測(cè)近、遠(yuǎn)期生存的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度均較高，表明術(shù)后MRD檢測(cè)對(duì)NSCLC術(shù)后生存具有重要預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上，術(shù)后基于ctDNA檢測(cè)MRD陽性是影響NSCLC患者根治術(shù)后近遠(yuǎn)期生存的危險(xiǎn)因素，有助于術(shù)后早期預(yù)測(cè)患者近遠(yuǎn)期生存率。但本研究中ctDNA檢測(cè)費(fèi)用較高且操作復(fù)雜，開展大樣本量研究較為困難；NSCLC根治術(shù)后常需輔助治療清除殘留病灶，ctDNA檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)發(fā)生變化，故在術(shù)后可連續(xù)監(jiān)測(cè)ctDNA評(píng)估MRD，以指導(dǎo)臨床早期調(diào)整治療方案，盡可能改善患者預(yù)后。