譚 斌,劉劍波,李芳芳,彭 艷,鐘月圓,鄧 暉,王秀麗 (郴州市第一人民醫(yī)院中心醫(yī)院消化內(nèi)科,湖南 郴州 423000)
胃癌是消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在我國(guó)惡性腫瘤中居第2位,病死率居第3位[1]。近年來(lái),醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步、手術(shù)方法的改進(jìn)、免疫治療及新輔助化療的應(yīng)用極大地延長(zhǎng)了胃癌患者的生存期,然而腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍不可避免,導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后差、生存質(zhì)量低[2-3]。因此,深入研究胃癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制極為必要。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵步驟之一,臨床上,EMT與癌癥預(yù)后不良密切相關(guān)[4-5]。染色體盒蛋白同源物7(chromosome box protein homologue 7,CBX7)是多梳蛋白家族中的一員,屬于黑腹果蠅的異染色質(zhì)蛋白在人類細(xì)胞中的同源物,主要分布于細(xì)胞核的染色質(zhì)中,通過(guò)與染色質(zhì)結(jié)合發(fā)揮作用[6]。CBX7的表達(dá)與多種癌癥的不良預(yù)后和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān),在癌癥發(fā)生和進(jìn)展中起著重要的作用[7-8]。研究發(fā)現(xiàn),CBX7在胃癌組織中低表達(dá),其低表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后和生存率低顯著相關(guān)[9],CBX7通過(guò)p16和Akt/NF-κB/miR-21信號(hào)通路調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性[10]。但CBX7對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的影響尚不明確。因此,本研究就CBX7對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的影響展開探討,并分析其潛在作用機(jī)制。
人胃癌細(xì)胞SGC7901(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù));CBX7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒、CBX7 siRNA和陰性對(duì)照siRNA(上海吉瑪生物公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(深圳華晨陽(yáng)科技有限公司);Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司);CCK-8試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ECL試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司);結(jié)晶紫染色液(武漢卡諾斯科技有限公司);Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室(美國(guó)BD公司);CBX7和GAPDH引物(上海捷瑞生物工程有限公司);RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒(大連寶生物工程有限公司);兔源GAPDH、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、磷酸酶張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen,PTEN)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)單克隆抗體及生物素偶聯(lián)的IgG二抗(英國(guó)Abcam公司)。
Heracell VIOS 160i細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司);PT-3502PC多功能酶標(biāo)儀(北京普天新橋技術(shù)有限公司);WMF-3690型倒置熒光顯微鏡(上海無(wú)陌光學(xué)儀器有限公司);JY-ZY5型電泳儀(濟(jì)南君意生物科技有限公司);RTQ-960 Pro qRT-PCR儀[艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司];KETA GL型凝膠成像系統(tǒng)(北京好億科技發(fā)展有限公司)。
人胃癌細(xì)胞SGC7901置于RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素,培養(yǎng)箱溫度為37 ℃,CO2濃度為5%。
按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書,將CBX7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒、CBX7 siRNA和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901細(xì)胞,依次記為pcDNA-CBX7組、pcDNA-NC組、si-CBX7組和si-NC組,同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組(NC組)。轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
收集各組SGC7901細(xì)胞,采用TRIzol試劑提取RNA并進(jìn)行定量,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明書配置實(shí)驗(yàn)體系,進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。引物序列如下:CBX7上游引物為5'-CATGGAGCTGTCAGCCATC-3',下游引物為5'-CTGTACTTTGGGGGCCATC-3';GAPDH 上游引物為5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3',下游引物為5'-CAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3'。 反 應(yīng)條件:95 ℃3 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 10 s,共40 次循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次,采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。
各組SGC7901細(xì)胞按1×104/mL接種至96孔培養(yǎng)板,設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔和空白孔,培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑孵育4 h,采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白孔OD值)×100%。
各組SGC7901細(xì)胞按1×105/mL接種至6孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,以200 μL移液槍槍頭垂直劃痕,做好標(biāo)記,PBS沖洗,加入RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,細(xì)胞遷移率(%)=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。
收集各組SGC7901細(xì)胞,取100 μL濃度為2×105/mL的細(xì)胞懸液接種至含有Matrigel基質(zhì)膠包被膜的Transwell小室上室,下室添加600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,孵育24 h后,清除上室細(xì)胞,用4%多聚甲醛固定穿過(guò)膜的細(xì)胞,并用0.1%結(jié)晶紫染色20 min,倒置顯微鏡下觀察,計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)目,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
蛋白裂解液提取各組SGC7901細(xì)胞總蛋白,BCA試劑盒定量,SDS-PAGE分離蛋白樣品,并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用5%脫脂牛奶封閉膜2 h,TBST洗膜,將膜與 CBX7、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PTEN、Akt、p-Akt、GAPDH 一抗(1∶1 000)在 4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜,加入IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h,ECL試劑顯影,分析蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
與NC組比較,pcDNA-NC組和si-NC組SGC7901細(xì)胞中CBX7 mRNA和蛋白表達(dá)量變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與pcDNA-NC組比較,pcDNA-CBX7組SGC7901細(xì)胞中CBX7 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著增加(P<0.05);與 si-NC組比較,si-CBX7組 CBX7 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著下降(P<0.05),見圖1,提示轉(zhuǎn)染效果良好。
圖1 SGC7901細(xì)胞中CBX7表達(dá)水平
與NC組比較,pcDNA-NC組SGC7901細(xì)胞存活率、遷移率及侵襲數(shù)變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與pcDNA-NC組比較,pcDNA-CBX7組SGC7901細(xì)胞存活率、遷移率及侵襲數(shù)均顯著下降/減少(P<0.05),見圖2,提示過(guò)表達(dá)CBX7抑制SGC7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。
圖2 過(guò)表達(dá)CBX7抑制SGC7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲
與NC組比較,pcDNA-NC組SGC7901細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)量變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與pcDNA-NC組比較,pcDNACBX7組SGC7901細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05),N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05),見圖 3,提示過(guò)表達(dá) CBX7抑制SGC7901細(xì)胞EMT進(jìn)程。
圖3 過(guò)表達(dá)CBX7抑制SGC7901細(xì)胞EMT
與NC組比較,si-NC組SGC7901細(xì)胞存活率、遷移率及侵襲數(shù)變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與si-NC組比較,si-CBX7組SGC7901細(xì)胞存活率、遷移率及侵襲數(shù)均顯著升高/增加(P<0.05),見圖4,提示下調(diào)CBX7促進(jìn)SGC7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。
圖4 下調(diào)CBX7表達(dá)促進(jìn)SGC7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲
與NC組比較,si-NC組SGC7901細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)量變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與si-NC組比較,si-CBX7組SGC7901細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05),N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05),見圖5,提示下調(diào)CBX7促進(jìn)SGC7901細(xì)胞EMT進(jìn)程。
圖5 下調(diào)CBX7表達(dá)促進(jìn)SGC7901細(xì)胞EMT
與NC組比較,pcDNA-NC組和si-NC組SGC7901細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)量、p-Akt/Akt變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與pcDNA-NC組比較,pcDNA-CBX7組SGC7901細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05),p-Akt/Akt顯著下降(P<0.05);與si-NC組比較,si-CBX7組SGC7901細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05),p-Akt/Akt顯著升高(P<0.05),見圖6,提示過(guò)表達(dá)CBX7通過(guò)上調(diào)PTEN抑制Akt信號(hào)通路活性。
圖6 CBX7對(duì)SGC7901細(xì)胞中PTEN/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響
胃癌起源于胃壁最表層的黏膜上皮細(xì)胞,可發(fā)生于胃的各個(gè)部位,是具有高度侵襲和轉(zhuǎn)移特性的惡性腫瘤。胃癌早期患者臨床癥狀不明顯,多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,而胃癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者病死率高和預(yù)后差的主要原因。因此,探究胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制,對(duì)降低胃癌患者病死率和改善預(yù)后具有重要意義。CBX7在哺乳動(dòng)物大腦、心臟及骨骼肌組織等中均有表達(dá),可維持機(jī)體組織的正常生長(zhǎng)發(fā)育。在細(xì)胞中,CBX7通常作為表觀遺傳調(diào)控因子調(diào)節(jié)基因表達(dá),然而,在病理狀態(tài)下CBX7的異常表達(dá)可導(dǎo)致基因表達(dá)失衡,這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在人類腫瘤中,CBX7起著雙重作用,一方面其通過(guò)抑制抑癌基因促進(jìn)某些癌癥的進(jìn)展;另一方面,其通過(guò)與不同分子的相互作用調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白合成,進(jìn)而抑制癌癥進(jìn)展[11-12]。在宮頸癌中,CBX7過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,作為抑癌因子發(fā)揮作用[13]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中,CBX7通過(guò)沉默CCNE1誘導(dǎo)細(xì)胞G1/S期阻滯,可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后標(biāo)志物[14]。此外,CBX7可作為miR-19及miR-18a等多種microRNAs的靶基因,對(duì)卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲及EMT發(fā)揮調(diào)控作用[15-16]。但CBX7對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響尚不清楚。本研究通過(guò)調(diào)控CBX7的表達(dá),分析CBX7對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)CBX7可抑制胃癌SGC7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,下調(diào)CBX7表達(dá)可促進(jìn)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,提示CBX7可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移和侵襲而調(diào)控胃癌進(jìn)展。
EMT是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,不僅包括細(xì)胞-細(xì)胞連接的溶解,還包括頂端外側(cè)極性的喪失。在EMT過(guò)程中,上皮細(xì)胞失去細(xì)胞黏附蛋白(如E-cadherin)和緊密連接蛋白的表達(dá),并同時(shí)表達(dá)豐富的N-cadherin和Vimentin等間充質(zhì)標(biāo)志物,從而完成從上皮到間充質(zhì)的表型轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞間黏附減少和運(yùn)動(dòng)性增加,使腫瘤細(xì)胞獲得較強(qiáng)的遷移性和侵襲性[17]。研究報(bào)道,復(fù)合物CBX7-PRMT1在調(diào)節(jié)E-cadherin表達(dá)和細(xì)胞遷移中起關(guān)鍵作用[18]。Tian等[19]報(bào)道,CBX7表達(dá)降低與宮頸癌EMT和不良預(yù)后相關(guān)。本研究探討CBX7表達(dá)變化與胃癌EMT的相關(guān)性,結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)CBX7后SGC7901細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)升高,N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)下降,下調(diào)CBX7表達(dá)后SGC7901細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)下降,N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)升高,提示CBX7可調(diào)控胃癌細(xì)胞SGC7901的EMT進(jìn)程。
腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移過(guò)程涉及多個(gè)信號(hào)途徑和多種分子機(jī)制,其中PTEN/Akt通路是近年來(lái)研究較多的相關(guān)通路之一。PTEN是一種磷酸酶,通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)各種轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)分子的活性,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡,并參與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。在胃癌發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中,PTEN/Akt信號(hào)通路參與胃癌血管生成以及胃癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和EMT等生物學(xué)過(guò)程。Zhou等[20]報(bào)道,靶向miR-21通過(guò)PTEN/Akt信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移。Wu等[21]報(bào)道,miR-616-3p通過(guò)PTEN/Akt/mTOR通路促進(jìn)胃癌血管生成和EMT。Qiang等[22]報(bào)道,姜黃素通過(guò)調(diào)控miR-21/PTEN/Akt通路,與PD98059協(xié)同誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡。還有研究顯示,CBX7可通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN/Akt信號(hào)通路抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[23]。本研究結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)CBX7顯著上調(diào)SGC7901細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá),使Akt磷酸化減少;而下調(diào)CBX7表達(dá)則使SGC7901細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)顯著下調(diào),Akt磷酸化增加。提示CBX7可通過(guò)調(diào)控PTEN/Akt信號(hào)通路參與胃癌細(xì)胞EMT進(jìn)程及細(xì)胞遷移和侵襲。
綜上所述,本研究證實(shí)過(guò)表達(dá)CBX7可抑制胃癌細(xì)胞增殖,并可通過(guò)抑制EMT抑制胃癌細(xì)胞遷移、侵襲,其機(jī)制可能是與調(diào)控PENT/Akt信號(hào)通路有關(guān)。因此,CBX7可能是胃癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的相關(guān)標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)。