商慶節(jié),姜曉飛,趙永曜,武衛(wèi)紅,史國玉,葛秀允 （.山東醫(yī)學高等?？茖W校藥學系，山東 濟南 5000；.山東省食品藥品審評查驗中心，山東 濟南 5004）

藥物代謝動力學簡稱藥代動力學，主要研究機體對藥物的動態(tài)變化規(guī)律，闡明藥物在機體內的吸收、分布、代謝、排泄過程及特征。非臨床藥代動力學研究結果能為臨床試驗設計和臨床試驗給藥方案的優(yōu)化提供相關參考。目前臨床前兩周期交叉藥代動力學實驗設計常用于研究藥物生物等效性或絕對生物利用度，常采用犬、猴等大動物，費用昂貴，增加了藥物開發(fā)成本。大鼠體型適中、性情溫順、易于繁育、經濟易得，但是其體質量相對較輕，血容量少，而因藥代動力學研究采血時間點多、清醒大鼠采血難度大等因素，目前大鼠的臨床前藥代動力學實驗多采用眼眶靜脈叢采血。眼眶靜脈叢采血對大鼠生長影響大，也不符合實驗動物“3R”福利的原則，嚴重制約了大鼠的藥代動力學兩周期交叉實驗設計。為克服大鼠眼眶靜脈叢采血難以應用于藥代動力學兩周期交叉實驗的劣勢，本研究采用清醒大鼠頸靜脈采血技術，通過生理鹽水口服灌胃和尾靜脈注射，模擬藥代動力學絕對生物利用度研究過程中常用的兩周期交叉實驗，探討藥代動力學兩周期交叉實驗中多次頸靜脈采血對大鼠體質量的影響，以期為大鼠的臨床前藥代動力學兩周期交叉實驗設計提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級SD大鼠，24只，雌雄各半，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK（魯）20190003，合格證號：370726220100830085，體質量200～240 g；飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%。60Co滅菌實驗動物飼料，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司(批號：20220715)；0.9%氯化鈉注射液，購于山東華魯制藥有限公司(批號：SD21112208)；一次性肝素鈉抗凝管（規(guī)格：0.5 mL），購于石家莊康衛(wèi)仕醫(yī)療器械有限公司(批號：210606)；一次性無菌注射器（規(guī)格：1 mL），購于安徽康泰醫(yī)療器具有限公司(批號：2022030)。

1.2 實驗設計

將24只SD大鼠按雌雄分開，分別稱量體質量后按簡化隨機法分成實驗組和對照組，每組12只，雌雄各半。實驗組大鼠模擬藥代動力學兩周期交叉實驗，兩周期交叉實驗給藥前12 h所有大鼠禁食不禁水，選取6只大鼠給予0.5 mL生理鹽水口服灌胃，另外6只大鼠給予0.5 mL生理鹽水尾靜脈注射，并分別于給藥前和給藥后0.1 h、0.2 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h采用清醒大鼠頸靜脈采血技術對大鼠采血0.1 mL，置于0.5 mL一次性肝素鈉抗凝管中抗凝，3 000 r/min離心10 min，取上層血漿于-20 ℃冷凍，并每日記錄大鼠體質量。1周后實驗組灌胃給藥大鼠與尾靜脈注射給藥大鼠交叉重復上述給藥操作，并繼續(xù)每日記錄大鼠體質量1周。未能一次性頸靜脈采血成功的大鼠可通過及時補采血的方式完成各時間點的采血，頸靜脈采血期間同時記錄頸靜脈采血成功率和大鼠存活率。對照組大鼠正常飼養(yǎng)不采血，僅在實驗組禁食不禁水期間同期禁食不禁水12 h，每日記錄大鼠體質量。

1.3 清醒大鼠頸靜脈采血技術

將大鼠置于飼養(yǎng)籠籠蓋或實驗臺上，采血者一只手向后牽拉鼠尾，在大鼠向前爬行時用另一只手抓住大鼠的頸背部皮膚，提起、翻轉，讓大鼠豎立，身體自然下垂，胸前部皮膚繃緊，面向采血者。將大鼠左上肢附近胸前毛發(fā)剃掉，用酒精棉球消毒。待酒精完全揮發(fā)后，以手按壓大鼠胸前消毒區(qū)域，找到胸骨舌骨肌與胸乳突肌形成的凹陷溝，此處即為大鼠頸靜脈采血位置，手持1 mL一次性無菌注射器，針尖斜面朝上，與大鼠胸部呈約45°夾角，沿著凹陷溝刺入針頭3 mm左右，輕輕抽取注射器栓使其呈負壓狀態(tài)，此時若無血液流出，可試探性前后進退注射器針頭，待血液自動流入注射器內達到采血量要求時，拔出注射器，用干棉球按壓止血，見圖1。

圖1 清醒大鼠頸靜脈采血

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，2組大鼠體質量以均數±標準差（）表示，采用重復測量數據的兩因素多水平統(tǒng)計分析，將干預因素作為A因素，每天稱量大鼠體質量的時間作為B因素，觀察2組大鼠體質量差異是否具有統(tǒng)計學意義，并考察時間和分組的交互作用。

2 結果

2.1 大鼠采血與存活情況

實驗組12只大鼠清醒狀態(tài)下兩周期交叉實驗的頸靜脈采血點共264個，單只大鼠在清醒狀態(tài)下每周期頸靜脈采血達11次，24 h內采血總量為1.1 mL，大鼠一次性頸靜脈采血成功率84.1%，每次頸靜脈采血可在20 s內完成，即使有個別需補采血的時間點，其整個采血時間也控制在1 min內。采集的血液經離心后分離的血漿大多呈淡黃色透明液體，極個別血漿有程度不一的溶血。所有實驗大鼠采血后狀態(tài)良好，存活率100%。

2.2 大鼠實驗期間體質量變化

對照組大鼠體質量隨大鼠周齡增加而穩(wěn)步增長，實驗組由于多次抓取和采血刺激，大鼠在采血期間體質量增長較慢，但由于大鼠自身恢復能力較強，每次采血后其體質量增長均能迅速恢復并接近于對照組大鼠，見表1。

表1 2組大鼠體質量比較（，n=12，g）

表1 2組大鼠體質量比較（，n=12，g）

時間第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天第8天第9天第10天第11天第12天第13天第14天對照組220.9±15.3 226.0±17.0 230.4±17.3 235.0±17.8 239.9±19.2 245.2±20.8 248.9±22.3 250.3±22.5 253.3±23.2 256.2±24.4 258.8±25.7 261.1±26.9 263.4±28.4 266.7±30.8實驗組221.1±16.8 221.4±17.9 226.5±17.5 232.0±18.4 237.7±18.8 243.4±18.9 248.9±20.4 248.1±20.8 250.8±21.5 253.6±22.7 256.3±23.7 259.2±25.0 262.3±26.9 265.4±29.1

重復測量數據的兩因素多水平統(tǒng)計分析結果顯示，不同組別的大鼠體質量檢驗結果差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），2組大鼠不同時間點體質量比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），時間和組別的交互作用無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

表2 2組大鼠兩因素多水平統(tǒng)計分析

3 討論

實驗大鼠的循環(huán)血容量一般為58～70 mL/kg[1]，為了降低采血對動物的影響，保證臨床前藥代動力學結果的準確性，國家藥品監(jiān)督管理局于2014年5月發(fā)布的《藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》建議盡量在動物清醒狀態(tài)下進行實驗，最好對同一動物多次采樣獲取藥代動力學參數，同時注意采血途徑和整個試驗周期的采血總量應不影響動物的正常生理功能，一般不超過動物總血量的15%~20%，每只大鼠24 h內采血總量不宜超過2 mL，在采血的同時兼顧動物福利。

常用的大鼠采血方式有眼眶靜脈叢采血法、舌下靜脈采血法、頸靜脈采血法、腹主靜脈采血法等[2-3]。大鼠藥代動力學研究需多次采血，由于腹主靜脈采血法和舌下靜脈采血法無法滿足多次采血的要求，因此目前大鼠藥代動力學研究最常用的采血方式是眼眶靜脈叢采血法和頸靜脈采血法。眼眶靜脈叢采血法采用玻璃毛細管扎破大鼠眼眶靜脈叢進行采血，采血過程中可能出現(xiàn)眼內液混入血液等情況，會影響凝血功能和血藥濃度的結果[4]，無法準確反映藥物在大鼠體內的藥代動力學真實過程。此外，非麻醉狀態(tài)下進行大鼠眼眶靜脈叢采血會造成動物疼痛、掙扎及其他應激反應，不符合實驗動物福利，且英國實驗動物“3R”國際中心提出眼眶靜脈叢采血法僅建議用于動物麻醉后的臨終前采血，或動物全麻狀態(tài)下沒有其他采血方法可代替時才能采用[5]。目前大鼠頸靜脈采血法成為了代替眼眶靜脈叢采血法的主流采血技術，為降低操作難度，許多操作者選擇麻醉后直接頸靜脈采血[6]，或者將大鼠麻醉后進行頸靜脈插管，利用頸靜脈留置管采集血液[7]。大鼠麻醉后直接頸靜脈采血雖然能降低采血操作難度，但麻醉藥物有可能影響藥物在動物體內的藥代動力學過程，且麻醉藥物的劑量難以掌握，容易導致動物死亡。此外，大鼠頸靜脈插管手術難度大，還需要一定量的抗凝劑封管，為了確保實驗的準確性，插管大鼠每次采血時需要棄去部分早期流出的混合了抗凝劑的血液，故插管大鼠每次實際采血量會超出設計采血量，容易影響大鼠正常的生理功能。

采用清醒大鼠頸靜脈采血技術可以滿足大鼠藥代動力學研究所需采血次數和采血量的要求。本實驗單只大鼠在清醒狀態(tài)下頸靜脈采血達11次，24 h內采血總量為1.1 mL，遠低于《藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》建議的24 h內采血總量不超過2 mL的標準；每次采集的0.1 mL血液在肝素鈉抗凝離心后能獲得40 μL左右的高質量血漿，結合高靈敏度的液質聯(lián)用儀或氣質聯(lián)用儀基本能滿足大部分藥物的血藥濃度分析測定；此外，大鼠的自身修復能力較強，經1周的洗脫期后，大鼠身體狀態(tài)基本可以恢復如初，能夠滿足下1個周期的藥代動力學采血需求，這為采用大鼠進行藥代動力學兩周期交叉實驗奠定了基礎。

本研究通過對實驗組大鼠進行生理鹽水口服灌胃和尾靜脈注射，模擬藥代動力學兩周期交叉實驗，結果顯示2組大鼠實驗期間的體質量差異無統(tǒng)計學意義，可以認為在大鼠藥代動力學兩周期交叉實驗期間多次頸靜脈采血不影響大鼠的正常生長，清醒大鼠頸靜脈采血技術可應用于大鼠藥代動力學兩周期交叉實驗研究，這為采用大鼠開展兩周期交叉藥代動力學實驗研究提供了理論依據。兩周期交叉實驗具有可消除個體間變異、統(tǒng)計精度高、可減少樣本量的優(yōu)勢，因此采用兩周期交叉實驗設計符合動物福利“3R”原則中的“減少”的原則。本研究采用小動物大鼠代替犬、猴等大動物進行兩周期交叉實驗，符合動物福利“3R”原則中的“替代”原則。本研究采用的清醒大鼠頸靜脈采血技術，具有隨抓隨采、單次采血時間短、操作相對簡單、對動物創(chuàng)傷小、采血量滿足實驗要求、可重復采血等優(yōu)勢，以此替代常用的大鼠眼眶靜脈叢采血和麻醉后頸靜脈采血等操作，也符合動物福利“3R”原則中的“優(yōu)化”原則。